Uitvoering en nut van genoombrede associatiestudies

In de rubriek Stand van zaken verschijnen regelmatig bijdragen over methoden die gebruikt worden bij het opzetten van wetenschappelijk onderzoek. De artikelen in deze serie illustreren op begrijpelijke wijze wat een bepaalde methode behelst, zonder dat hier uitvoerige methodologische kennis voor nodig is. Zowel oude als nieuwe methodologische principes worden zo inzichtelijk gemaakt voor artsen die klinische onderzoeken goed willen interpreteren.

De afronding van het internationale Human Genome Project in 2003 was een mijlpaal in de geschiedenis van biomedisch onderzoek.1 De volgorde van de 3 miljard DNA-baseparen in het humane genoom werd hiermee in kaart gebracht. Daardoor werd het mogelijk om de locatie in het DNA van zo’n 22.000 genen aan te wijzen, en de genetische variaties tussen mensen beter te onderzoeken.

Genetische variaties zijn over het hele genoom verspreid te vinden. Een belangrijk soort variatie is de zogenoemde ‘single nucleotide polymorphism’ (SNP, uitgesproken als ‘snip’; figuur 1). Inmiddels zijn miljoenen SNP’s ontdekt, die worden bijgehouden in de internationale database dbSNP (www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Genetische variaties zoals SNP’s zijn niet alleen geassocieerd met biologische kenmerken, zoals de kleur van iemands ogen, maar ook met verschillende ziekten. De kernvraag is: welke genetische variaties zijn dat, en welke genen liggen hier in de buurt die mogelijk invloed hebben op biologische kenmerken of betrokken zijn bij de etiologie van ziekten?

Genoombrede associatiestudies

In de nasleep van het Human Genome Project zijn er tal van technologische innovaties gekomen die het al sinds enige jaren mogelijk maken om honderdduizenden SNP’s verspreid over het genoom direct uit te lezen in grote aantallen DNA-monsters. Vervolgens kan deze informatie gekoppeld worden aan allerlei klinische en biologische metingen. Op die manier wordt in genoombrede associatiestudies (‘genome wide association study’, GWAS of GWA-studies) de relatie onderzocht tussen genetische variatie in ons DNA (genotype) en bepaalde kwantitatieve of kwalitatieve biologische kenmerken en ziekten (fenotype).2 Inmiddels zijn er ruim 6.000 associaties tussen genotype en fenotype ontdekt, waaronder associaties voor lichaamslengte, BMI, bloedwaarden van lipiden, bloeddruk, diabetes mellitus type 2, coronairlijden, herseninfarct en atherosclerose.3 Deze GWAS-resultaten worden overzichtelijk bijgehouden op een speciale website (http://www.genome.gov/gwastudies).3

In dit artikel leggen wij de achterliggende principes en methodes van GWA-studies uit aan de hand van 2 grote studies naar coronairlijden en LDL-cholesterolwaarden.4,5 Ook besteden we aandacht aan de statistische analyse en de interpretatie van associatieresultaten. Tot slot behandelen we de implicaties voor de klinische praktijk.

Zeldzaam of complex?

Mendeliaans overervende zeldzame ziekten

Het is van belang om een onderscheid te maken tussen mendeliaans overervende zeldzame ziekten en complexe multifactoriële aandoeningen. Bij mendeliaans overervende aandoeningen is vaak sprake van slechts 1 of enkele genetische variaties in 1 cruciaal gen (monogene afwijkingen), die verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van de ziekte. Door natuurlijke selectie zijn zulke variaties zeer zeldzaam in de algemene populatie; de ziekte openbaart zich gewoonlijk op jonge leeftijd en heeft vaak een zeer ernstig beloop, al vóór de reproductie.

Deze genetische variaties hebben een hoge penetrantie; als de penetrantie van de variatie bijvoorbeeld 80% is, wil dat zeggen dat 80% van de individuen met die variatie de ziekte zal krijgen. Het effect van de variaties met een hoge penetrantie is dus groot en is meetbaar bij de meeste personen met de afwijkende variant. Dat maakt het in principe mogelijk om families te screenen met prenatale diagnostiek (figuur 2). Zo zijn er specifieke variaties gevonden in het LDL-receptorgen (LDLR) en in PCSK9, het gen dat codeert voor het eiwit plasma proproteïneconvertase subtilisine/kexine type 9; variaties in deze genen veroorzaken familiaire hypercholesterolemie (FH).

Het klinisch beeld en de respons op behandeling kan variëren door de verschillende mutaties, en dat maakt het identificeren van de precieze varianten belangrijk. De genoemde genetische variaties en nog duizenden andere die verantwoordelijk zijn voor mendeliaans overervende aandoeningen, zijn te vinden in de ‘Online Mendelian Inheritance in Man’-database (www.omim.org).

Complexe ziekten en biologische kenmerken

In tegenstelling tot mendeliaans overervende aandoeningen komen veelvoorkomende ziekten doorgaans op latere leeftijd – na de reproductie – tot uiting; zij worden veroorzaakt door een complexe combinatie van genetische en niet-genetische factoren.6 De risicoallelen van deze multifactoriële en polygene ziekten lijken om die reden niet onderhevig aan natuurlijke selectie, zo veronderstelt de ‘common disease-common variant’-hypothese.7 Daardoor kunnen risicoallelen relatief vaak voorkomen in de algemene populatie (dit noemt men een hoge allelfrequentie), maar vertonen zij een lage penetrantie (zie figuur 2).

Het is dan ook lastig om associaties tussen veelvoorkomende ziekten en risicoallelen op te sporen; zeer grote groepen mensen zijn nodig om de kleine effecten van de risicoallelen aan te tonen. In een recente GWAS naar bloedwaarden van lipiden werden ruim 100.000 personen onderzocht, bij wie significante associaties op 95 onafhankelijke genetische loci werden gedetecteerd.5 Voor elke locus werd slechts een relatief klein effect op bijvoorbeeld de LDL-cholesterolwaarden gevonden; 3 van deze loci betroffen SNP’s in het LDLR-gen – maar niet dezelfde variant als degene die geassocieerd is met FH –, in het HMGCR-gen, dat codeert voor het enzym waar statines op aangrijpen (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA(HMG-CoA)-reductase), en PCSK9 (het aangrijpingspunt van PCSK9-antilichamen).5 Enkele van deze loci zijn ook geassocieerd met coronairlijden, wat het causale verband tussen LDL-cholesterol en coronairlijden treffend illustreert.4,8

Uitvoering van een GWAS

‘Linkage disequilibrium’

Het is gelukkig niet nodig om alle 3 miljard baseparen in het genoom direct uit te lezen om een GWAS uit te voeren. Het internationale HapMap-project en het ‘1000 Genomes’-project hebben inmiddels zo’n 40 miljoen SNP’s in meerdere populaties geïdentificeerd.9,10 Mede dankzij deze projecten is nu duidelijk dat SNP’s die dicht bij elkaar op het DNA liggen, sterk met elkaar gecorreleerd zijn, wat ‘linkage disequilibrium’ wordt genoemd.11 Door deze correlatie tussen SNP’s is het afdoende om binnen een locus slechts enkele SNP’s te genotyperen.

Met behulp van moderne microarray-chips kunnen de genotypen van ongeveer 500.000 tot 5 miljoen SNP’s efficiënt worden uitgelezen in grote aantallen DNA-monsters. Omdat van alle bekende SNP’s in het hele genoom tegelijk de relatie met een fenotype kan worden bestudeerd, worden GWA-studies ‘hypothese-vrij’ genoemd. Dat is de feitelijke kracht van GWAS: er wordt onbevooroordeeld gekeken naar genen die nog niet in verband zijn gebracht met een bepaald fenotype.

Statistiek

Vaak betreft een GWAS een patiënt-controlestudie, waarbij de allelfrequentie van een SNP in het genoom van patiënten wordt vergeleken met de allelfrequentie van diezelfde SNP in een controlepopulatie.11,12 Het verschil in allelfrequentie kan statistisch worden getoetst met een traditionele χ²-toets of logistische regressie.11 Andere GWA-studies onderzoeken juist kwantitatieve metingen, zoals bloedwaarden van LDL-cholesterol. In dat geval wordt lineaire regressieanalyse gebruikt om de relatie tussen SNP-genotype en de kwantitatieve bepaling te toetsen.

Bonferronie-correctie Doordat honderdduizenden SNP’s binnen hetzelfde experiment worden getest, moet een statistische correctie worden toegepast om het aantal fout-positieve bevindingen te minimaliseren. Meestal streeft men naar een kans van 5% op zo’n type-1-fout (dat is het vinden van een associatie terwijl die er in werkelijkheid niet is); deze kans wordt ook wel met α aangeduid. Bij de zogenaamde Bonferroni-correctie wordt de nagestreefde type 1-fout gedeeld door het aantal onafhankelijke statistische testen dat uitgevoerd wordt om de p-waarde te bepalen waarmee ‘significantie’ kan worden geclaimd. Door de sterke correlatie tussen SNP’s wordt voor een GWAS in het algemeen een p-waarde < 5,0 x 10^-8 gehanteerd als genoombreed significant. Dit komt neer op ongeveer 1 miljoen onafhankelijke testen.11,13

Manhattan-plot Door de p-waardes weer te geven over alle gemeten SNP’s in het genoom is het mogelijk om in een figuur de resultaten van een GWAS te visualiseren. Deze zogenaamde ‘Manhattan’-plots tonen de statistische significantie voor alle SNP’s in het genoom (figuur 3). Als meerdere significante regio’s in het genoom zijn geïdentificeerd, ontstaat een beeld dat enigszins doet denken aan de skyline van Manhattan.

Replicatiestudies

Het is van groot belang dat gevonden associaties gerepliceerd worden in onafhankelijke studies.2 Vaak wordt een GWAS daarom in 2 fasen uitgevoerd. Tijdens de ontdekkingsfase worden eerst alle associatieresultaten verzameld, vaak door meta-analyse van meerdere cohorten. De significante associaties worden vervolgens in een replicatiefasein onafhankelijke cohorten opnieuw getoetst op hun validiteit. Wanneer de resultaten significant blijven, wordt de associatie tussen SNP en fenotype robuust geacht.2

Op basis van de gevonden associaties is het nu duidelijk geworden dat de effectgroottes van geassocieerde SNP’s klein zijn, uitzonderingen daargelaten. Elke geassocieerde SNP draagt slechts een klein beetje extra risico bij. Dit verklaart ook waarom GWA-studies zulke grote studiepopulaties vereisen om genoeg power te hebben.2,12 Het verzamelen van zulke grote aantallen patiënten kan echter lastig zijn in de praktijk. Het opzetten van internationale consortia voor genetisch onderzoek is daarom van groot belang. De resultaten die met GWA-studies behaald zijn illustreren de etiologische complexiteit van ziekten, maar benadrukken ook dat biologische inzichten verkregen kunnen worden door juist nieuwe verbanden tussen genen en complexe fenotypes aan te wijzen.

Functionele relevantie

SNP’s worden aangeduid met een uniek rs-nummer in dbSNP, bijvoorbeeld rs6511720 voor de eerdergenoemde SNP in LDLR. In een GWAS-publicatie wordt vaak niet alleen het rs-nummer genoemd, maar ook de naam van een nabijgelegen gen, bijvoorbeeld LDLR, en de fysieke locatie in het genoom, bijvoorbeeld 19p13.2. Vanwege de regionale correlatie tussen SNP’s is het belangrijk te benadrukken dat een GWAS slechts een statistische associatie beschrijft tussen genotype en fenotype (figuur 4).

Als een verband is gevonden tussen een bepaald gen en een fenotype, is nog niet duidelijk wáár precies in een bepaald locus de causale variant ligt die verantwoordelijk is voor het functionele mechanisme achter de associatie14. De causale variant zou bijvoorbeeld een aminozuurverandering kunnen zijn in een eiwit of enzym. Maar variaties die een regulerende rol spelen bij de genexpressie kunnen net zo goed bijdragen aan het uiteindelijke effect. Door de gevonden genetische associaties te koppelen aan andere datasets is het ook mogelijk om specifieke celtypes te identificeren die een causale rol spelen in het ziekteproces.

Door sequencing of genotypering van nog grotere aantallen mensen in combinatie met aanvullend functioneel onderzoek in vitro en in vivozal het mogelijk worden om de causale varianten aan te wijzen en cruciale inzichten in het onderliggende mechanisme te verkrijgen. In de huidige generatie GWA-studies worden laagfrequente SNP’s gemist; wellicht kunnen studies die zich richten op het exoom (dat is de verzameling van coderende exonen van alle genen) daar verandering in brengen.

Wat hebben genoombrede associatiestudies opgeleverd?

Genetische predictie als klinische toepassing

In 2002 was het aantal gevalideerde associaties van SNP’s en complexe ziekten nog op één hand te tellen; dankzij GWA-studies is dat aantal in de laatste jaren omhooggeschoten.15 Wat dat betreft hebben GWA-studies ons veel nieuwe kennis over de genetica van complexe ziekten en eigenschappen opgeleverd.3 In de laatste jaren hebben velen ook kritiek geuit op GWA-studies vanwege de kleine effectgroottes van de SNP-associaties en de geringe voorspellende waarde.

Onderzoek heeft laten zien dat van minimaal 250 genen de varianten bekend moeten zijn om het voorspellende vermogen van de huidige risicomodellen te verbeteren, maar dit aantal zou in werkelijkheid misschien nog hoger kunnen liggen.16 Het is dan ook een illusie te denken dat slechts enkele tientallen SNP’s met een klein effect het risico voor de individuele patiënt op complexe, polygene ziekten adequaat kunnen voorspellen. De SNP’s die verband houden met coronairlijden zijn vooralsnog geen klinisch relevante toevoeging op traditionele predictiemodellen als de Amerikaanse ‘Framingham heart score’ of de Europese ‘Systemic coronary risk evaluation’ (SCORE).17,18 Toch zijn er bedrijven die consumenten rechtstreeks genetische testen aanbieden, zonder tussenkomst van een arts (‘direct-to-consumer’), waarmee de klant een persoonlijk genetisch profiel kan verkrijgen.19 Hoewel deze testen in technisch opzicht accuraat zijn, zullen zij vooralsnog weinig kunnen toevoegen aan de dagelijkse klinische praktijk.20

Nieuwe aangrijpingspunten voor geneesmiddelen

Toch hebben GWA-studies al veel nieuwe inzichten gegeven in de onderliggende moleculaire mechanismen van complexe aandoeningen en andere fenotypes.3-5,21 GWA-studies hebben de potentie om nieuwe aangrijpingspunten voor medicamenteuze behandeling te identificeren.22 Een voorbeeld hiervan zijn de statines, die het enzym HMG-CoA-reductase remmen en daardoor de LDL-cholesterolconcentratie en het risico op ischemische hartziekten verlagen. Er is een SNP in HMGCR die significant is geassocieerd met de LDL-cholesterolconcentratie, al heeft deze SNP maar een relatief klein effect, namelijk een verlaging of verhoging met 0,18 mmol/l.5 Hoewel dit effect bescheiden is, is het belang van dit gen en het enzym als therapeutisch doelwit evident.

Hetzelfde geldt voor de PCSK9-locus. Deze locus bevat een SNP (rs2479409) die is geassocieerd met een verhoging of verlaging van de LDL-cholesterolconcentratie met 0,05 mmol/l en een andere (rs11206510) dat is geassocieerd met coronairlijden (oddsratio: 1,08; 95%-BI: 1,05-1,11).4,5 In een andere studie zijn zeldzame varianten in PCSK9 gevonden die leiden tot functieverlies van het gen, wat resulteert in 47% reductie van het risico op coronaire hartziekte.23 Recent is aangetoond dat een monoklonaal antilichaam gericht tegen PCSK9 de LDL-cholesterolconcentratie significant verlaagt bij patiënten met FH, maar ook bij patiënten met niet-familiaire hypercholesterolemie en bij gezonde vrijwilligers.24 Verder klinisch onderzoek moet uitwijzen of dit gepaard gaat met een significante reductie in cardiovasculair risico; de eerste resultaten van dergelijk onderzoek worden rond 2018 verwacht.25

Conclusie

Accurate risicovoorspelling op basis van SNP-associaties lijkt op korte termijn niet haalbaar voor de klinische praktijk. De kracht van GWA-studies ligt in eerste instantie in het vergroten van kennis over de etiologie en het mechanisme van complexe ziekten. Hierdoor kunnen er mogelijk nieuwe aangrijpingspunten worden geïdentificeerd voor de ontwikkeling van biomarkers en therapieën. Waar de afgelopen 5 jaar vooral de hoogfrequente SNP’s centraal stonden in GWA-studies, zal de komende jaren door goedkopere sequencing-methoden steeds meer onderzoek gedaan worden naar de biologische rol van zeldzame of populatie-specifieke varianten.

Leerpunten

• In genoombrede associatiestudies wordt het hele genoom onderzocht op genetische variaties die verband houden met een bepaalde ziekte of biologische eigenschap.

• De meeste ‘single nucleotide polymorphisms’ (SNP’s) die bekend zijn hebben slechts een klein effect op biologische kenmerken, bijvoorbeeld de LDL-cholesterolconcentratie.

• Een associatie tussen een SNP en een aandoening wil niet zeggen dat er een causaal verband is.

• Op dit moment is het nog niet mogelijk om risico’s op ziekte accuraat te voorspellen aan de hand van SNP’s.

• De kennis over associaties tussen SNP’s en biologische kenmerken is nuttig voor de ontwikkeling van biomarkers en nieuwe therapeutica.