Galvorming en cholestase

Door toepassing van moleculair-biologische technieken is het inzicht in het proces van galvorming enorm toegenomen. Transporteiwitten die hierbij een essentiële rol spelen, zijn geïdentificeerd en gekloneerd. Deze eiwitten bevinden zich zowel in de hepatocyten, het epitheel van de intrahepatische galwegen als in het terminale ileum.

De actieve uitscheiding van galzouten vanuit de hepatocyt naar de galcanaliculus vormt de belangrijkste drijvende kracht voor de vorming van gal. De gal zorgt ervoor dat bepaalde slecht in water oplosbare stoffen het lichaam via het darmkanaal kunnen verlaten. In de darm zijn galzouten van belang voor vertering en opname van voedingsvetten. Het lichaam is zuinig op zijn galzouten: in het terminale ileum worden de galzouten vanuit het darmlumen heropgenomen. Dit wordt de enterohepatische kringloop genoemd. Om deze taak uit te voeren, beschikt het terminale ileum over een galzuurtransporteiwit, de ‘ileal bile acid transporter’ (IBAT).1 Per cyclus gaat minder dan 10 van de galzouten verloren. Dit verlies wordt gecompenseerd door nieuwe aanmaak van galzouten uit cholesterol in de lever.

de galvorming

Gal wordt primair door hepatocyten gevormd. Galcanaliculi zijn microscopisch kleine kanaaltjes die door hepatocyten worden omgeven (figuur 1). Via deze kanaaltjes bereikt de gal de kleinere en grotere galkanalen om tenslotte via de extrahepatische galwegen en de galblaas in de darm te worden uitgescheiden. In tegenstelling tot de galcanaliculi hebben de intrahepatische galkanalen hun eigen epitheelbekleding: de cholangiocyten.

Transporteiwitten voor opname vanuit het poortaderbloed

Voor de opname van galzouten en andere cholefiele stoffen uit het poortaderbloed beschikt de lever over een scala aan transporteiwitten. Hiervan zijn er inmiddels ongeveer 20 gekarakteriseerd. Ze bevinden zich in het sinusoïdale membraan van de hepatocyt. Dit is het deel dat grenst aan het bloed. Het natriumafhankelijke taurocholaattransporteiwit is het belangrijkste eiwit voor de opname van galzouten.2 Het transporteiwit voor organische anionen (OATP2) is van belang voor de opname van vele stoffen in de lever en mogelijk ook voor de opname van bilirubine.4 Of deze laatste stof ook inderdaad een OATP-substraat is, moet echter nog bewezen worden. Er zijn diverse OATP's; ze bevinden zich niet alleen in de lever, maar ook in de darm, de nieren, de longen, de zaadbuizen en de bloed-hersenbarrière. Het sinusoïdale membraan van de hepatocyt bevat ook transporteiwitten voor de opname van organische kationen. Ook deze eiwitten komen in vele andere organen voor, vooral in de nieren.5 6

Transporteiwitten voor excretie in de gal

Na opname in de hepatocyt worden galzouten, bilirubine en vele andere stoffen er aan de canaliculaire zijde weer uitgepompt. Het canaliculaire membraan van de hepatocyt is hiertoe uitgerust met een reeks ATP-afhankelijke transport- of ‘pomp’-eiwitten. Het woord ‘pomp’ duidt op een actief transportproces; dit zijn actieve transporteiwitten, die stoffen tegen een 100- tot 1000-voudige concentratiegradiënt naar de gal kunnen pompen. De belangrijkste canaliculaire transporteiwitten zijn de galzoutpomp (‘bile salt export protein’ (BSEP)), de pomp voor geconjugeerd bilirubine, glutathion- en glucuronideconjugaten (‘multidrug resistance associated protein 2’ (MRP2)) en ‘multidrug resistance protein 3’ (MDR3). Dit laatste eiwit behoort evenals BSEP tot de familie van de P-glycoproteïnen en zorgt voor de uitscheiding van fosfolipiden naar de gal.7-11 Hoewel sommige van deze eiwitten vooral in de lever voorkomen, spelen soortgelijke eiwitten in bijna elk orgaan een rol bij het transport van stoffen door het celmembraan. Evolutionair gezien zijn dit belangrijke eiwitten. Gisten en bacteriën bevatten eiwitten die een aanzienlijke homologie vertonen met de transporteiwitten van zoogdieren. Resistentie van bacteriën voor antibiotica en de resistentie van kankercellen voor geneesmiddelen is voor een deel te wijten aan overexpressie van dergelijke transporteiwitten. In de lever zijn ze betrokken bij de vorming van gal.

Transporteiwitten in het galgangepitheel

Niet alleen de hepatocyten, maar ook de intrahepatische galgangepitheelcellen bevatten transporteiwitten. Het bekendst is de cystische-fibrosetransmembraanregulator (CFTR). Dit eiwit vormt een chloridekanaal dat betrokken is bij de taaislijmziekte en dat ook voorkomt in de zweetklieren, de alvleesklier, de longen, de darmen en de zaadbuizen.12 Naast het CFTR bevat het intrahepatische galgangepitheel een groot aantal andere transporteiwitten, zoals MDR1, MRP3, het reeds genoemde galzuurtransporteiwit IBAT (behalve in het ileum is dit eiwit ook in het galgangepitheel en in de niertubuli aanwezig), waterkanalen (aquaporine 1 en 4), anionuitwisselingseiwit 2 (‘anion exchanger 2’, een eiwit betrokken bij de bicarbonaatsecretie) en andere elektrolytuitwisselingseiwitten.13-16

De aanwezigheid van transporteiwitten duidt erop dat galkanalen een actieve rol spelen bij de galvorming. In dit verband dringt zich de vergelijking met het nefron op, waar in de glomerulus de primaire urine wordt gevormd terwijl in de proximale en distale tubuli de urine wordt geconcentreerd, waarbij tevens allerlei stoffen worden geresorbeerd en andere worden uitgescheiden. Zo zou men in de lever kunnen spreken van primaire gal, die door de hepatocyten wordt gemaakt. In de galkanaaltjes verandert de galsamenstelling door toedoen van transporteiwitten. Dit laatste heeft waarschijnlijk te maken met het feit dat in de gal sprake is van een precaire balans tussen elkaar in oplossing houdend cholesterol, fosfolipiden en galzouten. Als het evenwicht verstoord is, slaat cholesterol neer in de vorm van galstenen. De transportfunctie van de galkanaaltjes dient ertoe om nuttige stoffen, zoals bepaalde aminozuren en galzouten, vanuit de gal terug te resorberen zonder dit evenwicht te verstoren. Daarnaast zorgt de intrahepatische kringloop van deze osmotisch actieve stoffen voor een extra nettoflux van water.

Leverstamcellen

Tussen de hepatocyten en de intrahepatische galgangen bevinden zich de kanalen van Hering.17 Deze kanalen zijn deels door hepatocyten en deels door galgangepitheel omgeven. Hier bevinden zich ook de ‘ovale cellen’, die wel als de stamcellen van de lever worden beschouwd. Deze cellen kunnen prolifereren en zijn pluripotent: zij kunnen uitgroeien tot zowel hepatocyten als cholangiocyten. Zolang bij ernstige leverschade het stamcelcompartiment onaangetast blijft, kan de lever regenereren.18 19 De stamcellen vertonen een sterke expressie van MDR1, MRP1 en MRP3.20 Deze transporteiwitten hebben hier waarschijnlijk een beschermende functie, omdat zij hepatotoxische stoffen de stamcel uit kunnen pompen.

progressieve familiaire intrahepatische cholestase type 1, 2 en 3

Genetische afwijkingen zijn spelingen van de natuur die inzicht kunnen verschaffen in de functie van een bepaald eiwit. Toen bekend werd dat BSEP het galzouttransporteiwit van de lever was, deed zich de vraag voor wat het fenotype van de ziekte zou zijn waarbij BSEP gemuteerd is. De aandacht richtte zich toen op congenitale cholestatische ziekten. Genetisch onderzoek had aangetoond dat het gen voor de ziekte van Byler, een vorm van congenitale cholestase die vooral, maar niet uitsluitend, bij de Pennsylvanian Dutch voorkomt, op chromosoom 18q21 ligt.21 Dit kon niet het gen voor BSEP zijn, want hiervan was inmiddels gebleken dat het op chromosoom 2q24 ligt. Ook was duidelijk dat er naast de ziekte van Byler nog tenminste 2 andere groepen patiënten met erfelijke cholestase waren. Voor één van deze groepen bleek het gen op chromosoom 2q24 te liggen.22 Strautnieks et al. hebben aangetoond dat deze patiënten een mutatie van het gen voor BSEP hebben,23 en wij hebben vervolgens gevonden dat het BSEP-eiwit hierbij niet tot expressie komt.24 Deze aandoening, die progressieve familiaire intrahepatische cholestase type 2 (PFIC-type 2) wordt genoemd, is de belangrijkste van de groep van familiaire intrahepatische cholestasesyndromen, waar inmiddels 3 subtypen van beschreven zijn. Deze zijn in de tabel vermeld. Karakteristiek voor de ziekte van Byler (PFIC-type 1) en voor PFIC-type 2 is een lage serumactiviteit van ?-glutamyltransferase (?GT), en dit ondanks de cholestase en de daarbijbehorende verhoogde alkalische-fosfataseactiviteit. De tot nu toe gevonden mutaties voor BSEP staan in figuur 2 afgebeeld. Figuur 3 geeft een schematische indruk van de pathofysiologische gevolgen van BSEP-deficiëntie bij patiënten met PFIC-type 2.

Het MDR3-gen codeert voor een canaliculair fosfatidylcholinetransporterend eiwit. Fosfatidylcholine is het belangrijkste fosfolipide in de gal en speelt een rol bij het in oplossing houden van cholesterol en het neutraliseren van de toxische werking van galzouten. Bij afwezigheid van het MDR3-eiwit, zoals dat het geval is bij PFIC-type 3, ontstaat er in de lever een beeld van ernstige galgangschade met galgangproliferatie en portale en periportale ontsteking en fibrose. PFIC-type 3 gaat gepaard met een hoge serumactiviteit van ?GT, hetgeen duidt op beschadiging van de intrahepatische galgangen waarin dit enzym voornamelijk gelokaliseerd is.25 26

benigne recidiverende intrahepatische cholestase en intrahepatische cholestase bij zwangerschap

Benigne recidiverende intrahepatische cholestase (BRIC) en intrahepatische cholestase tijdens de zwangerschap zijn aandoeningen waarbij de genoemde genen ook betrokken zijn. BRIC is een aandoening die gepaard gaat met perioden van geelzucht, jeuk en steatorroe. Tussen de aanvallen door is de leverfunctie normaal. Het gen voor deze ziekte ligt in hetzelfde locus als dat voor PFIC-type 1.27-29 Het lijkt dus waarschijnlijk dat waar bij PFIC-type 1 sprake is van een volledig gendefect, het bij BRIC gaat om een afwijkende regulatie van genexpressie. De rol van het bij deze aandoeningen betrokken gen, FIC1, is echter nog niet volledig opgehelderd.

In families met PFIC-type 3 komt de intrahepatische cholestase tijdens de zwangerschap met een verhoogde frequentie voor.30 31 Evenals dit bij PFIC-type 3 het geval is, hebben deze patiënten tijdens de periode van cholestase in het 3e trimester van de zwangerschap een verhoogde serumactiviteit van ?GT. Een aantal van deze patiënten blijkt heterozygoot voor de mutatie van het MDR3-gen te zijn. Dit is echter niet het einde van dit verhaal. Er zijn ook patiënten met een normale serum-?GT-activiteit. Mogelijk houdt deze vorm van zwangerschapscholestase verband met BRIC, want ook in families van BRIC-patiënten komt deze ziekte vaker voor.32

primaire biliaire cirrose

Primaire biliaire cirrose vertoont histologisch enige gelijkenis met het beeld bij PFIC-type 3. Bij primaire biliaire cirrose is er echter tevens een auto-immune ontregeling met vorming van antimitochondriale antistoffen. Het is niet uitgesloten dat galzouten betrokken zijn bij deze ontregeling. Mitochondriën zijn gevoelig voor galzouten en uit immunohistologisch onderzoek blijkt dat de autoreactiviteit zich voornamelijk richt tegen het mitochondriale pyruvaatdehydrogenase. Dus mogelijk zijn de antimitochondriale antistoffen het gevolg van een door galzouten geïnduceerde beschadiging van het galgangepitheel. Daarnaast zijn waarschijnlijk omgevingsinvloeden bij primaire biliaire cirrose van belang, hetgeen blijkt uit de zeer hoge prevalentie van de ziekte in sterk geïndustrialiseerde gebieden, zoals de omgeving van Newcastle upon Tyne.33-35 Wellicht leiden omgevingsinvloeden tot een ontregeling van MDR3-gemedieerd transport met galgangbeschadiging en stimulatie van autoreactiviteit tot gevolg.

dubin-johnson-syndroom

Het Dubin-Johnson-syndroom is een onschuldige aandoening, die gepaard gaat met een geconjugeerde hyperbilirubinemie. Inzicht in dit syndroom heeft een belangrijke stimulans gekregen door de ontdekking van de zogenaamde transportdeficiënte rat.36 Dit proefdier heeft een op het Dubin-Johnson-syndroom gelijkende aandoening als gevolg van een mutatie van het MRP2-gen;37 38 daardoor is er geen functioneel MRP2. Patiënten met het Dubin-Johnson-syndroom hebben een normale levensverwachting en zijn asymptomatisch, met uitzondering van een gele huid en ogen. Deze aandoening is net als bij de transportdeficiënte rat het gevolg van een mutatie van het bilirubine-glucuronidetransporteiwit MRP2 in het canaliculaire membraan van de lever.39-41 De verhoogde concentratie van geconjugeerd bilirubine in het bloed is het gevolg van een compensatoire toename van het MRP3-eiwit in het basolaterale membraan van de hepatocyt.42 43 Onder normale omstandigheden komt dit eiwit niet tot expressie in de lever, maar bij het Dubin-Johnson-syndroom wel. In tegenstelling tot MRP2 transporteert MRP3 bilirubineconjugaten van lever naar bloed. Histologisch is de lever bij patiënten met het Dubin-Johnson-syndroom normaal, met uitzondering van een karakteristiek zwart lysosomaal pigment.44

door geneesmiddelen geïnduceerde cholestase

Door geneesmiddelen geïnduceerde cholestase is voor een deel het gevolg van de interactie van geneesmiddelen met transporteiwitten in de lever. Hierbij zijn vooral het MRP2 en het BSEP van belang. BSEP kan zowel vanaf de cellulaire kant geremd worden (zogenaamde cis-inhibitie), als vanaf de canaliculaire kant (trans-inhibitie).45 Ciclosporine behoort tot de eerste categorie en estradiol (glucuronide) tot de tweede categorie van BSEP-remmers (figuur 4). Estradiol (glucuronide) wordt eerst via MRP2 in de gal uitgescheiden om vervolgens BSEP vanuit het canaliculaire lumen te remmen. In transportdeficiënte ratten die niet over MRP2 beschikken, veroorzaakt estradiol (glucuronide) dan ook geen cholestase.

Ook cytokinen kunnen de expressie van canaliculaire transporteiwitten beïnvloeden.46 Deze beïnvloeding vindt gedeeltelijk plaats op transcriptieniveau. Bij sommige vormen van virale hepatitis is er mogelijk sprake van een door cytokinen gemedieerde verminderde expressie van MRP2 en BSEP.

conclusie

Moleculair-genetisch en celbiologisch onderzoek heeft geleid tot een beter begrip van het proces van galvorming en tot identificatie van een aantal genetisch-cholestatische ziekten. Vanuit deze kennis is het wellicht mogelijk om ook complexere leverziekten te begrijpen en zo aanknopingspunten te vinden voor nieuwe behandelingsmogelijkheden.

Het onderzoek dat aan dit artikel ten grondslag ligt, vindt plaats in een samenwerkingsverband met de afdelingen Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde (hoofd: prof.dr.S.Poppema), Medische Oncologie (hoofd: mw.prof.dr.E.G.E.de Vries), Hepatobiliaire Chirurgie (hoofd: prof.dr.M.J.H.Slooff), Farmacokinetiek en Drug Delivery (hoofd: prof.dr.D.K.F.Meijer), Medische Genetica (hoofd: prof.dr.C.H.C.M.Buys) en het Centraal Dierenlaboratorium. Het werk wordt financieel ondersteund door de Rijksuniversiteit Groningen, het Academisch Ziekenhuis Groningen, de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek NWO, de De Cock Stichting, de Maag-, Darm- en Leverstichting, Tramedico BV, Astra-Zeneca Nederland BV en Byk-Gulden Nederland BV.