Azoolresistentie van Aspergillus fumigatus in Nederland

Resistentievorming is een bekend probleem bij bacteriën en virussen. Bij schimmels leek dit een minder groot probleem te zijn. Zo gingen we er lange tijd vanuit dat de schimmel Aspergillus fumigatus intrinsiek gevoelig is voor de gebruikte antifungale middelen. Een recent surveillanceonderzoek toont echter aan dat verworven resistentie van A. fumigatus wijdverbreid voorkomt in Nederland. Bij deze schimmel kunnen we niet meer uitgaan van gevoeligheid voor middelen van de azoolklasse.

In het tijdperk voor de antiretrovirale therapie werd resistentievorming ook bij gisten gezien bij hiv-positieve patiënten met orofaryngeale candidiasis die herhaaldelijk behandeld werden met fluconazol.1 De gist Candida bleek in staat allerlei resistentiemechanismen te ontwikkelen die tot therapiefalen leidden.1 Bij A. fumigatus lijkt de resistentievorming niet zozeer het gevolg te zijn van behandeling met azolen, maar eerder door blootstelling aan azoolfungiciden in het milieu.

Aspergillus fumigatus

A. fumigatus is een saprofytaire schimmel die algemeen in de natuur voorkomt, met name in grond en compost. De schimmel is in staat te groeien bij temperaturen tot 50°C en verspreidt zich gemakkelijk door middel van conidia (sporen) die zich met de lucht verplaatsen. Afhankelijk van de immuunstatus van de patiënt kan A. fumigatus een breed scala aan ziektebeelden veroorzaken, zoals allergische beelden, aspergilloom en chronische en acute invasieve aspergillose.2

Behandeling Aspergillus-ziekten De azolen spelen een belangrijke rol in de preventie en behandeling van Aspergillus-ziekten. In gerandomiseerd onderzoek hadden patiënten met invasieve aspergillose die behandeld werden met voriconazol een betere overleving dan patiënten behandeld met amfotericine B deoxycholaat.3 Chemoprofylaxe met posaconazol was effectief om invasieve aspergillose te voorkomen bij patiënten met hematologische maligniteiten of met ernstige graft-versus-hostziekte.4,5 Voor de behandeling van invasieve aspergillose wordt voriconazol als eerste keus aanbevolen en behandeling met posaconazol voor preventie van invasieve schimmelziekten bij bepaalde hoogrisicopatiëntengroepen.6 Itraconazol wordt toegepast bij de behandeling van niet-invasieve Aspergillus-ziekten zoals allergische bronchopulmonale aspergillose.7

De azolen zijn de enige klasse van de tegen Aspergillus werkzame antifungale middelen die oraal toegediend kunnen worden. Alternatieve middelen voor de behandeling van Aspergillus-ziekten zijn de lipideformuleringen van amfotericine B. Caspofungine heeft in-vitroactiviteit tegen Aspergillus-soorten, maar had een lagere effectiviteit dan voriconazol in klinisch onderzoek bij hematologische patiënten met invasieve aspergillose.8,9

Azoolresistentie

In 1998 werd voor het eerst een azoolresistente A. fumigatus-stam gekweekt bij een Nederlandse patiënt.10 Van 1945 tot dan toe waren alle klinische stammen en omgevingsstammen zonder uitzondering gevoelig gebleken.10 In 2007 werd een serie van 9 Nederlandse patiënten beschreven met azoolresistente invasieve aspergillose.11 In een daaropvolgend epidemiologisch onderzoek van een Nijmeegse collectie van klinische A. fumigatus-isolaten die tussen 1994 en 2007 waren verzameld, werd azoolresistentie gevonden vanaf het jaar 2000 en werd een jaarlijkse toename van de resistentie gevonden tot een prevalentie van 6% in 2007.12

Recentelijk zijn de resultaten van een prospectief surveillanceonderzoek gepubliceerd waaraan 7 Nederlandse Universitair Medische Centra deelnamen.13 Gedurende 20 maanden (juni 2007-januari 2009) werden 2062 Aspergillus-stammen afkomstig van 1385 patiënten onderzocht op resistentie, waarbij 82 azoolresistente stammen werden gevonden. Azoolresistentie werd in alle deelnemende centra gevonden, met een prevalentie variërend van 0,8-9,4% (gemiddelde: 5,3; figuur).13 De 82 azoolresistente stammen werden gekweekt bij 62 patiënten. Bij 23 van hen was een Aspergillus-ziekte vastgesteld; bij de overige 39 patiënten was er sprake van kolonisatie (aanwezigheid van de schimmel zonder dat er sprake is van een Aspergillus-ziekte) of van een klinisch niet relevante kweek. 15 patiënten hadden een niet-invasieve ziekte: aspergilloom (6 patiënten), allergische bronchopulmonale aspergillose bij cystische fibrose (5 patiënten), otomycose (3 patiënten) en sinusitis (1 patiënt).

Bij 8 patiënten werd ‘acute invasieve aspergillose’ gediagnosticeerd, bij 6 was de diagnose bewezen en bij 2 werd zij als waarschijnlijkheidsdiagnose gesteld. Bij 5 van de 8 patiënten presenteerde het ziektebeeld zich met pulmonale aspergillose. Deze patiënten werden behandeld met voriconazol, maar bij alle 5 faalde de therapie en overleden zij binnen 12 weken na de positieve kweek. De 3 andere patiënten met de diagnose ‘acute invasieve aspergillose’ hadden cerebrale aspergillose en werden eveneens behandeld met voriconazol, maar vervolgens ook met amfotericine B, caspofungine, posaconazol of combinaties hiervan. Van deze 3 patiënten overleden er 2. In totaal overleden dus 7 van de 8 patiënten met azoolresistente invasieve aspergillose. Dit is ongeveer 2 maal zo hoog als verwacht bij infecties door azoolgevoelige stammen (letaliteit 39-48%).13 Van de patiënten met een azoolresistente stam was 64% niet eerder behandeld met azolen.

Resistentiemechanismen

A. fumigatus kan resistent worden doordat er een puntmutatie ontstaat in het Cyp51A-gen. Deze mutaties veranderen waarschijnlijk de doorgankelijkheid van 2 kanalen die azolen gebruiken om de biosynthese van ergosterol, een belangrijk bestanddeel van de celmembraan van de schimmel, te verstoren. Meestal zijn hierdoor alle 3 azolen, namelijk itraconazol, voriconazol en posaconazol, niet of minder werkzaam. Er is inmiddels een lange lijst van puntmutaties in het Cyp51A-gen die gerelateerd zijn met het optreden van resistentie.

A. fumigatus kan resistent worden tijdens behandeling met azolen, maar dit is vrijwel uitsluitend beschreven bij Aspergillus-ziekten die gepaard gaan met holtevorming. Bij individuele patiënten kunnen mutaties in de schimmel ontstaan door azoolbehandeling, maar doordat Aspergillus-ziekten niet besmettelijk zijn, kunnen deze resistente stammen zich niet verder verspreiden. Deze route van resistentieontwikkeling wordt dus gekenmerkt door een grote diversiteit aan resistentiemechanismen.

Onderzoek naar de resistentiemechanismen van de Nederlandse stammen toonde echter geen grote verscheidenheid van puntmutaties. Integendeel, bij meer dan 90% van de azoolresistente stammen werd hetzelfde resistentiemechanisme gevonden. Dit bestond uit een puntmutatie in het Cyp51A-gen in combinatie met een tweede verandering in de promoterregio van dat gen, een zogenaamde ‘tandem repeat’, samen afgekort als TR/L98H. De dominantie van dit resistentiemechanisme is moeilijk te verklaren door resistentievorming als gevolg van azoolbehandeling. Zo zijn er geen aanwijzingen dat dergelijke complexere resistentiemechanismen, die bestaan uit een combinatie van genetische veranderingen, kunnen ontstaat door behandeling van patiënten. Ze worden echter wel gevonden in azoolresistente fytopathogene schimmels die resistent zijn geworden door blootstelling aan azolen in het milieu. De observatie dat bij 64% van de patiënten geen sprake was van voorafgaande blootstelling aan azolen, wijst in de richting van aanwezigheid van azoolresistente Aspergillus in ons milieu.

De rol van azoolfungiciden

Omgevingsonderzoek heeft aangetoond dat azoolresistente Aspergillus-stammen aanwezig zijn in het milieu, zoals in grondmonsters, water en zaden die gekocht werden bij een tuincentrum.14 Hierin werd hetzelfde TR/L98H-resistentiemechanisme aangetroffen als bij de patiëntisolaten.14 Azolen worden veelvuldig gebruikt voor gewasbescherming en voor het preserveren van voedsel en materialen tegen schimmelgroei. Gewassen zijn vatbaar voor aantasting door plantpathogene schimmels, wat grote economische schade veroorzaakt. Ook buiten de landbouw- en voedingsmiddelenindustrie worden azolen gebruikt, bijvoorbeeld in verf en badkamerverf, kit en behangplaksel. Ook leer, kleding en matrassen zijn vaak voorbehandeld met azolen.14

Om meer inzicht te krijgen in de rol van azoolfungiciden bij het optreden van resistentie zijn 31 schimmeldodende middelen, die in Nederland tussen 1970 en 2005 geautoriseerd zijn voor gebruik, onderzocht op activiteit tegen A. fumigatus.15 Immers, A. fumigatus is geen plantpathogene schimmel en is geen doelorganisme van azoolfungiciden. Tevens werd de molecuulstructuur van deze middelen vergeleken met die van de medische azolen. Er werden 5 azoolfungiciden geïdentificeerd die qua molecuulstructuur sterke gelijkenis vertoonden met de medische triazolen.15 Deze 5 fungiciden, propiconazol, bromuconazol, tebuconazol, epoxiconazol en difenoconazol, waren, evenals de medische azolen, van de triazoolklasse. Ze toonden goede in-vitroactiviteit tegen de azoolgevoelige A. fumigatus-stammen maar hadden geen enkele activiteit tegen de TR/L98H-stammen.15 Opvallend was dat deze 5 fungiciden geautoriseerd zijn tussen 1990 en 1996, enkele jaren voordat de eerste TR/L98H-schimmel werd gekweekt in 1998.

Implicaties van resistentievorming in het milieu

We beginnen inzicht te krijgen in de gevolgen van resistentievorming in het milieu bij A. fumigatus. De efficiënte sporevorming maakt het mogelijk dat resistente stammen zich gemakkelijk kunnen verspreiden. In Nederland en Denemarken zijn de TR/L98H-stammen in het milieu aangetroffen,16 en recentelijk werd het TR/L98H-resistentiemechanisme ook aangetoond in klinische stammen uit Denemarken, België, Frankrijk, Italië en Oostenrijk.17 Tevens zijn deze stammen in China en India bij patiënten gevonden, wat de potentie tot mondiale verspreiding onderstreept.18,19 Het is waarschijnlijk dat de aanwezigheid van TR/L98H-stammen in het milieu leidt tot klinische infecties door inademing van deze resistente sporen.

Verwacht mag worden dat het niet bij de TR/L98H-mutatie blijft, aangezien het gebruik van azoolfungiciden doorgaat en daarmee de blootstelling van A. fumigatus aan deze middelen in het milieu aanwezig blijft. Zeer recent werd inderdaad een nieuw resistentiemechanisme gevonden (aangeduid met TR₄₆/Y121F/T289A) dat zich, vergelijkbaar met TR/L98H, snel heeft verspreid in Nederlandse ziekenhuizen en eveneens in het milieu werd aangetroffen.20 In 2010 steeg de prevalentie van resistentie naar 8,3%, waarvan 2,3% werd veroorzaakt door dit nieuwe resistentiemechanisme.

Een andere implicatie is dat in principe elke patiënt met een Aspergillus-ziekte een azoolresistente stam kan hebben. Het Nederlandse surveillanceonderzoek heeft laten zien dat bij ongeveer tweederde van de patiënten een azoolresistente stam werd gevonden zonder voorafgaande blootstelling van de patiënt aan azolen. Er zijn op dit moment geen evidente risicofactoren voor aanwezigheid van resistentie aan te wijzen, wat het vooraf identificeren van patiënten met resistente Aspergillus-ziekte niet mogelijk maakt.

Maatregelen

In oktober 2010 heeft er onder voorzitterschap van het Centrum Infectieziektenbestrijding van het RIVM een deskundigenberaad plaatsgevonden om de medische en publieke gezondheidszorgaspecten van azoolresistentie te bespreken. Vanuit deze expertgroep werd geadviseerd om in Nederland actieve surveillance uit te gaan voeren. Per oktober 2011 is het UMC St Radboud door het ministerie van VWS aangewezen als referentielaboratorium dat in samenwerking met het Centrum Infectieziektenbestrijding surveillance zal uitvoeren. De deskundigen hebben tevens geadviseerd om de Stichting Werkgroep Antibioticabeleid (SWAB)-richtlijn ‘Invasieve mycosen’ te herzien ten aanzien van de behandeling van invasieve aspergillose. Daarnaast werd aanbevolen om meer onderzoek te verrichten naar de oorzaak van resistentieontwikkeling in het milieu en het probleem op te bespreken met het European Centre for Disease Prevention and Control.

Ook het bureau Risicobeoordeling en Onderzoeksprogrammering van de nieuwe Voedsel en Waren Autoriteit heeft op verzoek van de toenmalige ministeries van VWS, VROM en Landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit een risicoanalyse uitgevoerd. Het advies, dat eveneens in oktober 2010 werd uitgebracht, was om meer onderzoek te verrichten naar de oorzaak van resistentievorming in het milieu. Ook adviseerde het bureau om te onderzoeken in welke mate en op welke termijn de resistentie van A. fumigatus afneemt als het gebruik van azoolfungiciden wordt gestaakt en vervangen door alternatieve schimmeldodende middelen. Op grond van de conclusies van zo’n onderzoek kunnen maatregelen worden genomen om de ontwikkeling van nieuwe resistentiemechanismen in Nederland gewasbescherming gehandhaafd blijft. Helaas zijn er nog geen initiatieven genomen om de oorzaak van azoolresistentie in het milieu daadwerkelijk te onderzoeken.

Consequenties voor de klinische praktijk

Uit dierexperimenteel onderzoek blijkt dat resistentie van grote invloed is op therapiesucces. Bij muizen met een infectie door een A. fumigatus-stam met een minimaal remmende concentratie (MRC) van 16 mg/l voor posaconazol, was het middel bij alle geteste doseringen onwerkzaam. Zelfs een beperkte stijging van de MRC van 0,06 mg/l naar 0,5 mg/l resulteerde al in belangrijk verminderde overleving van de dieren.21 Vergelijkbare bevindingen werden gevonden met voriconazol en lijken in overeenstemming te zijn met de klinische ervaring.15,22

Op basis van schattingen hebben in 2010 een kleine 60 patiënten een azoolresistente invasieve aspergillose ontwikkeld. Daarnaast zullen andere patiënten niet-invasieve Aspergillus-ziekten ontwikkelen met een azoolresistente stam. Gezien het brede scala van Aspergillus-ziektebeelden zullen veel medisch specialisten rekening moeten houden met deze nieuwe realiteit. Ook de medisch microbiologische laboratoria dienen alert te zijn op resistentie en A. fumigatus-stammen te testen op resistentie tegen azolen. Aspergillus-stammen kunnen ook opgestuurd worden naar het referentielaboratorium.

MRC’s kunnen bepaald worden als Aspergillus gekweekt wordt. Echter, bij ongeveer 70% van de patiënten met invasieve aspergillose is de schimmelkweek negatief. Met moleculaire technieken is het mogelijk een resistentiemutatie direct in klinische monsters aan te tonen, waardoor we zelfs in kweek-negatieve patiënten kunnen vaststellen of er sprake is van azoolresistentie. Deze technieken bevinden zich echter nog in de onderzoeksfase en zijn niet algemeen beschikbaar.23,24

Kennis van de lokale epidemiologie is van belang om te kunnen inschatten of de prevalentie van azoolresistentie aanpassingen noodzakelijk maakt van het antifungale behandelingsbeleid. Bij uitzondering kan soms een van de azolen nog worden ingezet, afhankelijk van de onderliggende mutatie en de MRC voor dat middel. Alternatieven voor voriconazol zijn een lipideformulering van amfotericine B of een combinatie van voriconazol met een echinocandine. Er zijn echter weinig tot geen wetenschappelijke gegevens die het gebruik van deze alternatieven bij azoolresistente aspergillose ondersteunen.

In vitro lijkt de activiteit van amfotericine B en de echinocandines tegen azoolresistente stammen gelijk aan de activiteit tegen azoolgevoelige stammen.12 Dierexperimenteel onderzoek naar de combinatie voriconazol en anidulafungine toonde aan dat combinatietherapie synergistisch werkte bij infecties met een azoolgevoelige stam, maar slechts additief bij azoolresistente infectie.25 Het is mogelijk dat bij volledige ongevoeligheid van A. fumigatus voor voriconazol, de effectiviteit van de combinatie volledig berust op de effectiviteit van anidulafungine, die suboptimaal is.25 Meer onderzoek is nodig om therapiekeuzes bij azoolresistentie te onderbouwen.

Er zijn 2 patiëntcategorieën waar nu al therapeutische problemen optreden. De eerste is de groep patiënten met chronische azoolresistente Aspergillus-ziekten met langdurige, al dan niet ambulante behandeling voor wie geen orale alternatieven voorhanden zijn. De tweede is de groep patiënten met cerebrale aspergillose, voor wie er geen alternatieven zijn die een vergelijkbare intracerebrale concentratie bereiken als voriconazol.

Conclusie

Met het ontstaan van een omgevingsroute van resistentieontwikkeling bij A. fumigatus is een nieuwe werkelijkheid ontstaan met belangrijke uitdagingen op het gebied van de diagnose en behandeling van patiënten met Aspergillus-ziekten. Het is van belang dat onderzoek wordt verricht naar de wijze waarop A. fumigatus resistent wordt in ons milieu, om effectieve maatregelen te kunnen nemen. Bij het uitblijven van dit onderzoek zal het probleem van azoolresistentie verder toenemen en de behandeling van patiënten met azoolresistente Aspergillus-ziekten verder compliceren, niet alleen in Nederland maar wereldwijd.

Leerpunten

• De schimmel Aspergillus fumigatus kan resistentiemechanismen ontwikkelen waardoor deze ongevoelig wordt voor itraconazol, voriconazol en posaconazol.

• Van de A. fumigatus-stammen die gekweekt werden uit klinische materialen in Nederlandse ziekenhuizen was 0,8-9,4% resistent voor azolen.

• In Nederland komt er een dominant resistentiemechanisme voor, aangeduid als TR/L98H. Het ontstaat waarschijnlijk in ons milieu, waar azolen veel worden toegepast voor gewasbescherming en voor het preserveren van voedsel en materialen.

• Het is aannemelijk dat de aanwezigheid van deze stammen in het milieu leidt tot klinische infecties door inademing van deze resistente sporen.

• Azoolresistentie is gerelateerd aan therapiefalen. Van 8 patiënten met azoolresistente invasieve aspergillose waren 7 binnen 12 weken overleden.

• Alternatieven voor behandeling zijn mogelijk de lipideformulering van amfotericine B of een combinatie van voriconazol met een echinocandine, maar er zijn nog weinig gegevens beschikbaar om deze keuzen te ondersteunen.

• Ook bij patiënten met een Aspergillus-ziekte die niet eerder azooltherapie hebben ontvangen, dient men rekening te houden met de mogelijkheid van resistentie.