NKB-NWO-Deelwerkgemeenschap Tumorimmunologie

Citeer dit artikel als
Ned Tijdschr Geneeskd. 1992;136:1528-36
Download PDF

Vergadering gehouden op 14 en 15 november 1991 te Vianen

L.T.C.Peltenburg, R.D.M.Steenbergen, R.Dee en P.I.Schrier (Leiden), Een onverwachte DNA-sequentie is betrokken bij de afschakeling van HLA-klasse I-expressie in melanomen

Het oncogen c-myc dat in ongeveer de helft van een aantal onderzochte melanoomcellijnen is geactiveerd, blijkt de expressie van ‘major histocompatibility complex (MHC) I’ (‘human leucocyte, system A’ (HLA)-klasse I)-genen af te schakelen. De eiwitten die door deze genen worden gecodeerd, spelen een belangrijke rol in de herkenning van tumorcellen door het immuunsysteem. De afschakeling blijkt voornamelijk produkten van het HLA-B-locus te betreffen. Het mechanisme van deze locus-specifieke afschakeling hebben wij onderzocht door het bestuderen van een panel melanoomcellijnen met variërende c-myc-expressie en invers correlerende HLA-klasse I-expressie. Omdat werd verwacht dat de afschakeling zou plaatsvinden op het niveau van transcriptie-initiatie, hebben wij eerst de bindingsactiviteit van de belangrijkste MHC-klasse I-‘enhancer’, enhancer A, in ‘gelretardation assays’ onderzocht. Er werden geen verschillen in de bindingscapaciteit van H2TF-1 (transcriptiefactor die specifiek aan enhancer A bindt) gevonden tussen cellijnen met een hoge en die met een lage c-myc-expressie. Bovendien werden er slechts kleine verschillen gevonden tussen functionele activiteit van enhancer A-CAT-‘reporter’-constructen in een melanoomcellijn met een lage c-myc-expressie en in de bijbehorende c-myc-transfectant, hetgeen doet vermoeden dat enhancer A niet betrokken is bij de afschakeling van HLA-B door c-myc. Dit resultaat was zeer onverwacht, omdat een sterk aan c-myc verwant gen, N-myc, in neuroblastomen wèl via enhancer A de HLA-klasse 1-expressie beïnvloedt. Wij hebben daarom vervolgens een ander regulerend gebied, dichter bij de coderende regio, in de HLA-B7-‘promoter’ bestudeerd. Een plasmide met een DNA-fragment uit dit gebied geplaatst tussen een sterke ‘Moloney murine leukemia virus’ (MoMLV)-enhancer en het CAT-reporter-gen was in een stabiele c-myc-transfectant 5 tot 10 maal minder actief dan in de originele cellijn met lage c-myc-expressie. Verder hebben wij aanwijzingen dat de aanwezigheid in grote kopieaantallen van dit DNA-fragment in een cellijn met een hoge c-myc-expressie, de HLA-B-expressie weer omhoog kan brengen. Dit samen doet vermoeden dat een DNA-bindende factor, die door c-myc wordt geïnduceerd, de reguliere expressie van HLA-klasse 1 kan moduleren via binding aan een DNA-sequentie in het promoter-gebied van deze genen.

P.J.K.Kuppen, A.M.M.Eggermont, S.P.G.Lazeroms, C.J.H. van de Velde en G.J.Fleuren (Leiden), Bepaling van activeringsstructuren op ‘large granular lymphocytes’ van de Wag-rat ten behoeve van immunotherapie. met ‘lymphokine-activated killer’-cellen in combinatie met bispecifieke antilichamen

Immunotherapie met ‘lymphokine-activated killer’ (LAK)-cellen is in enige mate effectief gebleken bij niertumoren en melanomen. Het meest efficiënt zijn zogenaamde adherente LAK (ALAK)-cellen. Het gaat hier om een pure populatie van ‘large granular lymphocytes’ (LGL) die met een hoge dosis interleukine-2 (IL-2) gekweekt zijn. Een van de mogelijke oorzaken van de geringe effectiviteit in vivo is dat LAK-cellen niet specifiek naar de tumor gaan. Door gebruik te maken van LAK-cellen die gepreïncubeerd zijn met een bispecifiek antilichaam – dat een vrij Fab-fragment heeft, gericht tegen een antigeen aanwezig op tumorcellen – kan men LAK-cellen mogelijk wel (langer) op de plaats van de tumor laten blijven. Een voorwaarde waaraan een antigeen op de LAK-cel voor dit doel moet voldoen is dat na binding van een antilichaam geen remming van lysis mag plaatsvinden. Het zou zelfs een voordeel zijn wanneer de binding van het antilichaam aan een ALAK-structuur tegelijkertijd zou leiden tot activering van het lysismechanisme. Voor de rat-LGL-marker NKR-P1, evenals voor CD2, is al aangetoond dat binding van een antilichaam leidt tot activering.

Wij zijn begonnen met het testen van verschillende ALAK-herkennende antilichamen op effect op lysis. Wij gebruikten hiervoor de tumorcellijn P815, die Fc-receptoren tot expressie brengt op zijn oppervlakte. Hierdoor wordt via de Fc-staart van de antilichamen op de ALAK-cellen brugvorming tussen effectorcel en ‘target’-cel bereikt. Deze brugvorming tussen P815 en ALAK-cellen via antilichamen leidt tot verhoogde lysis van P815 indien het antilichaam gebonden is aan een activeringsstructuur op ALAK-cellen. Als controle werd de Fc-receptor-negatieve cellijn YAC-1 gebruikt.

ALAK-cellen van Wag-ratten werden gekweekt volgens een standaardprocedure. De verkregen ALAK-cellen bleken, zoals verwacht, positief te zijn voor ‘major histocompatibility complex’ (MHC) klasse I en II, NKR-P1, CD2 en CD8. CD4 en de T-celreceptor waren niet aanwezig op de cellen. Dit fenotype toont aan dat deze ALAK-cellen LGL zijn. Het bleek dat de lysis van P815 door ALAK-cellen in aanwezigheid van anti-CD8, anti-CD2 of anti-NKR-P1 aanzienlijk hoger was dan zonder deze antilichamen. Anti-CD4 had, evenals anti-MHC klasse I of II, geen hogere lysis van P815 tot gevolg. De lysis van de negatieve controle-cellijn, YAC-1, door ALAK-cellen werd in het geheel niet beïnvloed door deze antilichamen. Onze resultaten tonen aan dat behalve NKR-P1 en CD2 ook CD8 een ALAK-activeringsstructuur is. Zowel CD2, NKR-P1 als CD8 lijkt daarom zeer geschikt om gebruikt te worden voor een tumorgerichte immunotherapie met behulp van bispecifieke antilichamen en ALAK-cellen. Twee bispecifieke antilichamen (anti-CD2anti-tumor en anti-CD8anti-tumor) zijn reeds ontwikkeld en worden nu getest op effect op tumorlysis.

E.Sturm, E.Braakman en R.L.H.Bolhuis (Rotterdam), De rol van T-cel-antigeen-receptor-??-lymfocyten in de immunorespons

De TCR??-lymfocyten vertegenwoordigen ongeveer 3-10 van de T-lymfocytenpopulatie. De meerderheid van de TCR??-lymfocyten in de periferie beschikt over een V?9-V?2-genrangschikking, terwijl een minderheid een V?1-genrangschikking gebruikt. De meeste TCR??-lymfocyten brengen het CD4- of het CD8-molecuul niet tot expressie en de antigeenherkenning is niet-‘major histocompatibility complex’(MHC)-gerestricteerd.

Nadat TCR??-lymfocyten in vitro geactiveerd zijn, kunnen ze door middel van niet-MHC-gerestricteerde lysis een grote scala van tumor-doelwitcellen lyseren. TCR??-lymfocyten kunnen ook specifiek zijn voor bepaalde antigenen, zoals CD1c, T-cel-doelwit-antigeen (TCT-1), of MHC-moleculen, zoals ‘human leucocyte, system A’ (HLA)-A2, A23, DR7 en DQw6. Ook kunnen TCR??-lymfocyten, net als TCR??-lymfocyten, antigenen herkennen wanneer deze gepresenteerd worden door een MHC-molecuul. Het receptortype dat voornamelijk gebruikt wordt door antigeen-specifieke TCR??-lymfocyten is V?1.

Het feit dat de gehele V?g-V?2-populatie de CD45-isoform, CD45RO, expresseert, die verband houdt met een reeds eerdere activering, doet vermoeden dat deze activering heeft plaatsgevonden als reactie op één antigeen of een familie van nauw verwante antigenen, de zogenaamde superantigenen. Zo'n superantigeen zou dan alom aanwezig moeten zijn. Autologe en mycobacteriële ‘heat shock proteins’ zijn alom aanwezig en vormen kandidaten voor deze superantigenen. TCR??-lymfocyten reactief met mycobacteriële antigenen zijn gevonden in de laesies van leprapatiënten en in de synoviale vloeistof van artritispatiënten. Deze bevindingen leidden tot de hypothese dat TCR??-lyfocyten een belangrijke rol spelen bij mycobacteriële immuniteit. Heat shock proteins worden onder normale omstandigheden niet geëxpresseerd op de membraan. Wanneer echter een cel geïnfecteerd of beschadigd wordt, is het mogelijk dat deze beschadigde cel het heat shock protein tot expressie brengt. Deze expressie kan dan leiden tot de activering van de V?9-V?2-lymfocyten in vivo. De fysiologische rol van deze V?9-V?2-lymfocyten zou het produceren van lymfokinen kunnen zijn waarmee een immunorespons wordt opgewekt. Een andere mogelijkheid is dat de V?9-V?2-lymfocyten direct de beschadigde cel opruimen en-daarmee het individu beschermen. De aanwezigheid van TCR??-lymfocyten voordat de antigeen-specifieke TCR??-lymfocyten ten tonele komen bij infecties met Bacillus Calmette-Guérin geeft de indruk dat TCR??-lymfocyten als een eerste verdedigingslinie fungeren. De proliferatie en klonale expansie van de antigeen-specifieke TCR??-lymfocyten duurt enkele dagen. De rol van TCR??-lymfocyten ligt waarschijnlijk in de eerste stadia van de immunorespons bij de herkenning van ‘stress’-signalen en bacteriële infecties.

J.van Dijk, R.L.H.Bolhuis, G.J.Fleuren en S.0.Warnaar (Leiden), Niercarcinoom: diagnostische en therapeutische toepassingen van monoklonale antilichamen

Niercarcinoom is een vrij zeldzame vorm van kanker. De 5-jaarsoverleving van niercarcinoompatiënten met metastasen op afstand is echter laag, kleiner dan 5. Op dit moment is nog geen algemeen werkende curatieve therapie voorhanden. Hieruit blijkt dat patiënten gebaat zijn met nieuwe methoden voor opsporing en behandeling van niercarcinoom. Daarom werd de laatste jaren onderzoek gedaan naar de mogelijke toepassingen van monoklonale antilichamen (MAbs) gericht tegen niercarcinoom voor de diagnostiek en therapie van het niercarcinoom.

Perfusie van tumor-dragende nieren met 99mTc-gelabelde MAbs G250 en RC38 resulteerde in opname van deze MAbs in de tumor, terwijl opname door normaal nierweefsel gering was. Verder bleek dat inspuiten van F(ab‘)2-fragmenten van het MAb G250 in niertumor-dragende naakte muizen in een verhoogde tumorbloed-verhouding resulteerde in vergelijking met intact G250-IgG. Dit impliceert dat voor het zichtbaar maken van primaire tumor en metastasen bij patiënten kleinere antilichaamfragmenten de voorkeur genieten.

Patiënten met niercarcinoom lijken redelijk goed te behandelen te zijn met immunotherapie, dat wil zeggen behandeling met interleukine-2 (IL-2), vaak in combinatie met geactiveerde immuuncellen. Een probleem hierbij is echter het onvermogen van deze immuuncellen om specifiek in de tumor te lokaliseren. Een methode om specifieke lokalisatie van immuuncellen in de tumor te krijgen, waarbij tevens deze tumorcellen gedood worden, is wellicht het gebruiken van bispecifieke MAbs, die zowel immuuncellen als tumorcellen kunnen binden. Het blijkt dat bispecifieke MAbs, reagerend met het CD3-antigeen op T-cellen enerzijds en met het G250-antigeen op tumorcellen anderzijds, in staat zijn selectief T-cellen aan te zetten tot lysis van alleen niercarcinoom-cellijnen. Voor deze inductie zijn slechts zeer geringe hoeveelheden bispecifiek MAb nodig.

Uit eerder onderzoek is gebleken dat niercarcinoom gevoelig is voor verschillende soorten cytokinen, zoals interferon (IFN) en tumornecrosisfactor (TNF). Maar de hoge mate van toxiciteit, verband houdend met toenemende doses cytokinen, is een beperkende factor bij de therapie. Uit ons onderzoek blijkt dat behandeling van niertumor-dragende naakte muizen met alleen MAb G250 of met alleen de cytokinen IFN-?TNF-? resulteerde in een significante tumorgroei-inhibitie ten opzichte van niet-behandelde muizen. Verdere groeiremming werd gevonden na behandeling met een combinatie van IFN-?TNF-? en MAb G250. Bij enkele muizen werd een volledige tumorregressie waargenomen.

Uit ons onderzoek moge derhalve blijken dat MAbs, gericht tegen antigenen voorkomend op niercarcinoom, bruikbaar kunnen zijn in de diagnostiek en – al dan niet in combinatie met cytokinen – in de therapie van niercarcinoom.

S.Osanto, M.Vierboom, N.Weijl en A.Voesten (Leiden), Toxiciteit en immuunmodulerende effecten van lage doses OKT3-monoklonale antistof, gericht tegen CD3 van de T-cel-receptor, bij kankerpatiënten

Lage doses tegen CD3 gerichte monoklonale antilichamen kunnen in vitro T-lymfocyten activeren en in diermodellen tumorregressie en tumorimmuniteit bewerkstelligen. Er werden 9 kankerpatiënten behandeld met lage doses OKT3 in een 48 uur durende continue infusie. OKT3 induceert een snelle, reversibele depletie van lymfocyten, voornamelijk CD4-T-cellen, uit het perifere bloed, een significante toename van het percentage T-cellen, die de p75-subunit van de interleukine-2 (IL-2)-receptor (belangrijk voor signaaltransductie) exprimeren, een toename in het expressieniveau van IL-2R-p75 en een toename van aantallen circulerende p75-IL-2R-T-cellen. In mindere mate is er een toename van het percentage p55-IL-2R en ‘human leucocyte, system A’ (HLA)-DR-positieve T-cellen. Toediening van OKT3 induceert sterk verhoogde serumspiegels van tumornecrosisfactor (TNF)-?, licht verhoogde interferon (IFN)-?-spiegels, maar nauwelijks een verhoging van IL-2-spiegels. Deze bevindingen, samen met het ontbreken van modulatie van CD3, duiden op T-celactivering in vivo.

Y.van Oosterhout, F. Preijers, H.Wessels en T.de Witte (Nijmegen), Internalisatie en cytotoxiciteit van immunotoxinen

De cytotoxiciteit van immunotoxinen (IT's) wordt bepaald door dichtheid en internalisatiecapaciteit van het antigeen en intracellulaire ‘routing’ van het IT. De kinetiek van de internalisatiecapaciteit is tot nog toe onvoldoende onderzocht. Door ons werd de mate van cytotoxiciteit (de monoklonale antistof WT32 gekoppeld aan het toxine ricine A) gerelateerd aan de internalisatiekinetiek (WT32).

De mate van cytotoxiciteit blijkt afhankelijk te zijn van de incubatieduur met het IT, maar ook van het moment waarop deze gemeten wordt. Daarbij kunnen de volgende factoren een rol spelen: internalisatie van intitieel gebonden IT, vertraagde werking van reeds intracellulair IT of continue internalisatie door reëxpressie van antigeen. Om de invloed van de eerste 2 factoren te elimineren werden de cellen eerst 24 uur gedurende variabele tijden (1-24 uur) geïncubeerd met IT, gewassen en verder geïncubeerd in IT-vrij medium. Pas daarna werd de mate van cytotoxiciteit bepaald. Uit de zo verkregen resultaten werd geconcludeerd dat continue internalisatie van WT32-ricine A door reëxpressie van antigeen waarschijnlijk is.

Om de continue internalisatie van WT32-ricine A te kunnen bewijzen werd de internalisatiekinetiek van WT32 bij 37°C bestudeerd. Bepaald werden de hoeveelheid membraangebonden WT32, het intracellulair gehalte en het afgebroken en geëxocyteerd WT32. De hoeveelheid geïnternaliseerd WT32 is gedefinieerd als de som van het intracellulair gehalte en het afgebroken en geëxocyteerd WT32, en deze som blijkt gedurende minimaal 24 uur te stijgen. De snelste stijging vindt plaats in de eerste 12 uur. De afbraak en exocytose van WT32 bleek na 2 uur al aanzienlijk te zijn. De totale hoeveelheid geïnternaliseerd WT32 was na 24 uur veel groter dan de maximale hoeveelheid die aan het membraan gebonden zou kunnen worden. Dit impliceert een reëxpressie van het CD3-antigeen binnen 24 uur.

Additie van NH4Cl en monensine versterkt de cytotoxiciteit van WT32-ricine A. Omdat deze ‘enhancers’ geen invloed bleken te hebben op de binding van WT32 aan het celmembraan of de internalisatiekinetiek, moet de intracellulaire degradatie en daaropvolgende exocytose verlaagd zijn. Dit werd bevestigd door een verhoogd intracellulair WT32-gehalte dat werd gevonden.

Deze observaties geven aan dat de effectiviteit van IT-behandeling voorspeld kan worden aan de hand van opname en degradatie van het betreffende monoklonale antilichaam gedurende continue incubatie.

E.Hooijberg, P.van den Berk, Y.Bruggeman, A.Hekman en C.Melief (Amsterdam), Constructie en eigenschappen van een chimerische muis-humane antistof gericht tegen het B-celantigeen, CD19

Antistof-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) wordt beschouwd als een belangrijk mechanisme betrokken bij de anti-tumor-effecten van monoklonale antistoffen in vivo.

Ofschoon monoklonale antistoffen van de muis gericht tegen CD19, CLB-CD19 (isotypen IgG-1, -2a, -2b) ineffectief gebleken zijn in het mediëren van ADCC met humane grote lymfocyten (LGL) als effectoren in vitro, hebben wij laten zien dat de behandeling van 6 patiënten met progressief non-Hodgkin-B-cellymfoom met monoklonale antistoffen CLB-CD19 isotype IgG-2a resulteerde in een partiële remissie bij 1 patiënt en in een minimale respons bij een andere patiënt.1

Immunotherapie bij B-cellymfoom zou mogelijk verbeterd kunnen worden door gebruik te maken van chimerische muis-humane antistoffen gericht tegen CD19, waarin het muis-Fc-gedeelte van CLB-CD19 isotype IgG-2a vervangen is door humaan IgG-1. De vorming van humane anti-muis-antistoffen (HAMA) zou daarmee verminderd worden, terwijl de interactie tussen de Fc-staart van de antistof en de Fc-receptor op de effectorcellen juist verbeterd wordt.

Gebruik makend van de methoden beschreven door Orlandi et al. (1989) hebben wij DNA-constructen gemaakt die de variabele gedeelten van CLB-CD19 dragen en de constante domeinen van humaan IgG-1 en kappa lichte keten. De lichteen zware-ketenconstructen zijn door middel van elektroporatie getransfecteerd in de muis-myeloma-cellijn SP20. De verkregen chimerische muis-humane, tegen CD19 gerichte monoklonale antistoffen zijn getest op hun specificiteit en zullen zeer binnenkort in vitro worden getest op hun affiniteit en capaciteit wat betreft het bewerkstelligen van tumorlysis door ADCC en door complementactivering.

B.J.Kroesen, A.ter Haar, H.Spakman, P.Willemse, D.Sleijfer, N.Mulder, T.H.The en L.de Leij (Groningen), Lokale immuuntherapie bij kanker met behulp van geactiveerde cytotoxische T-cellen gericht tegen de tumor door middel van bispecifieke antilichamen

Activering van geïsoleerde lymfocyten met een tegen CD3 gericht monoklonaal antilichaam (MAb) gevolgd door in vitro-kweek gedurende enkele dagen in een medium dat een lage dosis interleukine-2 (IL-2) bevat, resulteert in een geactiveerde T-celpopulatie met potentieel cytotoxische activiteit. Door in vitro-incubatie van de geactiveerde T-cellen met het bispecifiek monoklonaal antilichaam Bis-1 (gericht tegen zowel het CD3-complex op de T-cel als tegen het pan-carcinoma-geassocieerd antigeen MOC 31) wordt een functionele brug gevormd (‘herrichting’) tussen de T-cel en de tumorcel. Hierdoor kan herkenning en lysis van MOC31-positieve tumorcellen door de cytotoxische T-cellen plaatsvinden.

In een pilot-onderzoek kregen 10 carcinomapatiënten met door tumor geïnduceerde ascites of door tumor geïnduceerd pleuravocht een behandeling die inhield dat ongeveer 109 autologe, ex vivo geactiveerde cytotoxische T-cellen intraperitoneaal respectievelijk of intrapleuraal werden teruggegeven. Bij 4 van deze patiënten werden, in een longitudinaal onderzoek, deze T-cellen afwisselend ex vivo herricht met Bis-1 of niet. Op verschillende tijdstippen na teruggave van de al of niet herrichte T-cellen werden ascites- of pleuramonsters genomen en histologisch geanalyseerd. Er werden 4 uur na teruggave conjugaten waargenomen van geactiveerde lymfocyten met tumorcellen. Deze conjugaten werden waargenomen na behandeling met herrichte, maar ook na behandeling met niet-herrichte geactiveerde T-cellen. Na 24 uur werd een vermindering van het aantal tumorcellen gevonden; de vermindering was tussen 24 en 72 uur na teruggave maximaal en was in geval van behandeling met herrichte T-cellen groter. Bij 1 patiënt bleef de ascites 4 weken tumorcel-vrij; de ascitesproduktie nam sterk af gedurende deze periode. Er werd een sterke ontstekingsreactie waargenomen in geval van behandeling met herrichte T-cellen, resulterend in een duidelijke granulocyteninflux in ascites of pleuravocht. Een dergelijke ontstekingsreactie was wel aanwezig, maar duidelijk minder sterk bij behandeling met niet-herrichte T-cellen. Parallel aan deze granulocyteninflux werd toegenomen regulatie van het voor cellulaire cytotoxiciteit belangrijke adhesiemolecuul ICAM-1 waargenomen in tumorcellen. Deze toegenomen regulatie, resulterend in een toename van adhesieve eigenschappen van de tumorcellen, zou kunnen bijdragen tot de sterke conjugaatvorming en de waargenomen cytotoxiciteit.

J.A.C.Voorthuis, E.Braakman, C.P.M.Ronteltap, N.E.B.A.M.van Esch en R.L.H.Bolhuis (Rotterdam), T-cel-receptorCD3-complexen op cytotoxische T-lymfocyten hebben beperkte signaaltransductiecapaciteit

Bispecifieke monoklonale antistoffen (bs-MAb, anti-CD3 x MOV18), die zowel het CD3-complex op cytotoxische T-lymfocyten (CTL) als een met humaan ovariumcarcinoom (OVCA, waarvoor MOV18 specifiek is) geassocieerd antigeen (gp38) herkennen, activeren CTL om OVCA-cellen te lyseren. De vraag is of met bs-MAb beladen CTL in staat zijn meer dan één doelwitcel te lyseren, net als antigeen-specifieke CTL. Gekloneerde CTL werden beladen met bs-MAb, werden gewassen om niet-gebonden bs-MAb te verwijderen en werden gedurende verschillende perioden (van 0 tot 24 uur) geïncubeerd met of zonder OVCA-cellen. Hierna werden de CTL van de OVCA-cellen geoogst en weer getest op hun capaciteit om met 51Cr gelabelde OVCA-cellen te lyseren in een secundaire 3 uur durende cytotoxiciteitstest. Zonder OVCA-cellen of samen met irrelevante doelwitcellen behouden met bs-MAb beladen CTL een aantal dagen hun door bs-MAb gemedieerde lytische capaciteit. Samen met OVCA-cellen echter verliezen met bs-MAb beladen CTL hun lytische activiteit binnen 3-6 uur. De bs-MAb-dichtheid op deze CTL is wel iets afgenomen, maar zou nog ruim voldoende moeten zijn om doelwitcel-lysis te induceren. Na toevoeging van nieuwe bs-MAb zijn deze CTL wel weer in staat om OVCA-cellen te lyseren, hetgeen aantoont dat het cytotoxisch potentieel van de CTL nog steeds operationeel is. De inactivering van met bs-MAb beladen CTL kan op verschillende manieren verklaard worden. Zo kan de antigeenbindingsplaats van bs-MAb op de CTL bezet zijn met gp38 als gevolg van de eerste OVCA-cel-dodende interactie. Ook is het mogelijk dat met bs-MAb beladen CD3-complexen die een activeringssignaal hebben doorgegeven tijdens de eerdere interactie met OVCA-cellen daarna niet in staat zijn continue activeringssignalen door te geven. Complexvorming van bs-MAb op de membraan van de CTL, met een konijn-anti-muis-antilichaam, veroorzaakt een verhoging van de intracellulaire calciumconcentratie. Geen verhoging van de intracellulaire calciumconcentratie werd echter waargenomen na complexvorming van bs-MAb-op geïnactiveerde CTL. Dit doet vermoeden dat inactivering van met bs-MAb beladen CTL veroorzaakt wordt door inactivering van de signaaltransductiecapaciteit van die CD3-complexen welke beladen zijn met bs-MAb die eerder betrokken zijn geweest bij de signaaltransductie. Opnieuw toegevoegd bs-MAb bindt waarschijnlijk aan T-celreceptorCD3-complexen op de CTL die voorheen nog niet betrokken zijn geweest bij een interactie met OVCA-cellen en die daarom nog in staat zijn tot het doorgeven van een activeringssignaal. Dat wil zeggen dat de CTL meerdere lytische cycli kan doorlopen, maar de individuele T-celreceptorCD3-complexen niet.

G.D.M.Beun, Y.Nooyen, A.Gorter, C.J.H.van de Velde en G.J.Fleuren (Leiden), Pre-klinische exploratie van behandelingsmogelijkheden met bispecifieke monoklonale anti-T-celreceptor-anti-tumor-antilichamen in een rat-coloncarcinoommodel

Met behulp van bispecifieke anti-T-celreceptor-anti-tumor-antilichamen kunnen, in vitro, niet-specifieke cytotoxische T-cellen in staat worden gesteld tot het herkennen en lyseren van tumorcellen. Dergelijke bispecifieke antilichamen worden sinds enige tijd in ons laboratorium geproduceerd en gezuiverd teneinde dierexperimentele analyse van potentiële behandelingsstrategieën in een rat-coloncarcinoommodel mogelijk te maken. In 4 of 18 uur durende 51Cr-release-tests versterkten bispecifieke antilichamen de cytolytische activiteit van geactiveerde rat-T-cellen versus rat-coloncarcinoom CC531 slechts in beperkte mate. 51Cr-release bleek echter de biologische schade, toegebracht aan CC531, te onderschatten: cocultivatie gedurende 3 dagen van effector- en doelwitcellen resulteerde in het werkelijk afsterven van alle of vrijwel alle tumorcellen bij effector-doelwitverhoudingen rond 1:1, mits tevens humaan recombinant interleukine (rIL)-2 (Amgen; Thousand Oaks, Ca., USA) werd toegevoegd. Oriënterende in vivo-experimenten gaven de indruk dat voortdurende biologische beschikbaarheid van IL-2 hier evenzeer noodzakelijk is voor significant anti-tumor-effect door in vitro geactiveerde T-cellen. Voorts werden aanwijzingen gevonden dat in ons model het door Bolhuis en medewerkers beschreven, van vrij beschikbare bispecifieke antilichamen afhankelijke ‘recycling’-fenomeen van groot belang is voor efficiënte tumorneutralisatie.

In het serum van tumor-dragende ratten detecteerden wij overigens krachtige T-celproliferatie-remmende activiteit die in normaal ratteserum niet werd aangetroffen. Aard en betekenis van deze serumfactor(en) voor bispecifieke therapie zijn vooralsnog onduidelijk.

A.Pötgens, G.van Altena, N.Lubsen, J. Schoenmakers, D.Ruiter en R.de Waal (Nijmegen), Oplosbare factoren uit humane melanoomcellijnen die de expressie van ‘tissue’-factor in endotheelcellen induceren

Achtergrond

Intravasculaire stolling wordt vaak waargenomen in het vaatbed van tumoren. Er zijn sterke aanwijzingen dat tumorcellen factoren kunnen uitscheiden die een werking hebben op het nabijgelegen endotheel, daarbij leidend tot verhoging van de procoagulantie-activiteit. In vitro kon dit worden bevestigd door incubatie van endotheelcellen in melanoom-geconditioneerd medium. Dit resulteerde in een verhoging van het messenger-RNA (mRNA)-niveau van ‘tissue’-factor en in een toegenomen procoagulantie-activiteit.

Methoden en resultaten

Uit kweeksupernatantia van BLM, een humane melanoomlijn, konden wij via heparine-sefarose-affiniteitschromatografie 2 activiteitspieken isoleren. De hiermee corresponderende eiwitten worden momenteel opgezuiverd. Verder zoeken wij in een complementair-DNA (cDNA)-expressiebank van BLM naar de sequenties die voor deze factoren coderen door cellen die met deze cDNA's getransfecteerd zijn functioneel te screenen in het procoagulatie-assay. Een van de activiteitspieken van de heparine-sefarose-kolom is waarschijnlijk een al langer bekende factor: ‘vascular permeability factorvascular endothelial growth factor’ (VPFVEGF). Dit eiwit induceert naast procoagulatie-activiteit ook de proliferatie van endotheelcellen, een toegenomen permeabiliteit van bloedvaten en in vivo-angiogenese. Wij hebben 3 cDNA-klonen van VPF geïsoleerd die in lengte verschillen als gevolg van differentiële ‘splicing’. Ze coderen dus ook voor eiwitten van verschillende lengte, en wij zullen gaan onderzoeken of deze vormen tevens functioneel van elkaar verschillen. Verder hebben wij in een panel van humane melanoomlijnen de expressie van VPF op RNA-niveau bestudeerd. De eerste experimenten wijzen uit dat de lijnen die in naakte muizen tumoren veroorzaken met de hoogste metastaseringsfrequenties, ook de hoogste niveaus van VPF-mRNA hebben.

Conclusie

Onze resultaten rechtvaardigen de hypothese dat VPF een rol speelt bij de angiogenese, en indirect bij de metastasering van deze tumoren.

E.van de Wiel-van Kemenade, M.J.L.Ligtenberg, A.J.de Boer, C.J.M.Melief, J.Hilkens en C.G.Figdor (Amsterdam), Episialine als een anti-adhesiemolecuul in de interactie van cytotoxische lymfocyten met melanoomcellen

Episialine is een sterk geglycosyleerd eiwit dat op het celoppervlak van epitheliale cellen tot expressie komt. Op normaal epitheel komt het eiwit alleen aan de zijde van de aan- of afvoergangen van het klierweefsel tot expressie. Episialine wordt ook afgescheiden en komt voor in slijm en serum. Op carcinoomcellen van epitheliale oorsprong komt het eiwit echter in sterk verhoogde mate tot expressie, maar dan niet alleen aan de apicale zijde van de cel, maar over het gehele celoppervlak. Episialine is een erg groot (300 kD), lang en star molecuul. Het steekt uit de celmembraan in de ruimte tussen de cellen. Vanwege deze eigenschappen is het zeer waarschijnlijk dat episialin een rol speelt in cel-cel-contact. Een positief effect zal het molecuul hebben op vorming en openhouden van aan- en afvoergangen in klieren. Tegelijkertijd kan het molecuul een negatief effect hebben op die functies waarbij intensief cel-cel-contact noodzakelijk is, zoals in de interactie tussen cytotoxische cellen en doelwit (‘target’)-cellen. In deze interactie zorgt een aantal adhesiemoleculen voor een intensief contact tussen effectorcellen en target-cellen. ‘Lymphocyte function associated-antigen-1’ (LFA-1) op de effectorcel bindt met ‘intracellular adhesion molecule-1’ (ICAM-1) op de target-cel. Verder bindt CD2 op de effectorcel met LFA-3 op de target-cel. Wij hebben onderzocht in hoeverre tumorcellen die in hoge mate episialine tot expressie brengen nog gevoelig zijn voor cytotoxische activiteit van effectorcellen. Hiervoor werden melanoomcellen, die geen episialine tot expressie brengen, getransfecteerd met het episialine-complementair-DNA (c-DNA), opdat deze cellen het eiwit zouden produceren en het tot expressie zouden brengen op de celmembraan. Gekozen werd voor transfectie van de melanoomcellijn A375, omdat deze cellijn gevoelig is voor lysis door lymfokine-geactiveerde effectorcellen. Getest werd de gevoeligheid voor lysis van 3 getransfecteerd A375-cellijnen en 2 controle-cellijnen (revertanten, die geen episialine meer tot expressie brengen) en de oorspronkelijke melanoomcellijn. Tot onze verrassing was er nauwelijks verschil in gevoeligheid voor lysis tussen de cellen met en zonder episialine-expressie. Zodra echter één van de adhesiegebeurtenissen, de LFA-lICAM-l-interactie, verhinderd werd door het toevoegen van monoklonale antistoffen tegen deze moleculen, was lysis van de episialine-getransfecteerde cellen niet langer mogelijk, terwijl de revertanten en de oorspronkelijke melanoomcellijn in vrijwel gelijke mate gevoelig bleven voor lysis. De vorming van celconjugaten van effectorcellen met episialine-getransfecteerde melanoomcellen was duidelijk verminderd vergeleken met de vorming van conjugaten met revertanten van de oorspronkelijke melanoomcellen. Hieruit kunnen wij concluderen dat episialine-expressie op tumorcellen lysis van deze cellen niet verhindert, ondanks het feit dat er minder conjugaten worden gevormd tussen effector- en target-cellen. Zodra echter de adhesiegebeurtenissen tussen effectorcellen en target-cellen niet optimaal zijn, treedt er een sterke vermindering op van lysis van deze met episialine-c-DNA getransfecteerde cellen. Mogelijk is expressie van het episialine molecuul op tumorcellen in vivo een mogelijkheid om aan cytotoxische activiteit van lymfocyten te ontsnappen.

M.Visseren, E.van der Voort, M.Koot, H.Schoenmaker, L.Gravestein, C.Voorthuizen en C.Melief (Leiden), Produktie van interleukine-2 door muizetumorcellen geïnfecteerd met recombinant retrovirus

Het gen dat codeert voor muize-interleukine-2 (IL-2) is gekloneerd in een niet-replicerend retrovirus (pLJ). EL4-tumorcellen (thymomacellen uit een B6-muis) zijn geïnfecteerd met dit gemanipuleerde virus (EL4pLJ-IL-2) of met het gewone virus (EL4pLJ). EL4pLJ-IL-2-cellen produceren in vitro IL-2, terwijl EL4pLJ-cellen geen IL-2 produceren. Subcutaan inspuiten van 105 EL4pLJ-cellen in B6-muizen induceerde in alle muizen het ontstaan van grote tumoren. Hetzelfde aantal EL4pLJ-IL-2-cellen veroorzaakte echter niet in alle muizen een tumor. Alleen het subcutaan inspuiten van een zeer grote hoeveelheid EL4pLJ-IL-2-cellen (107) veroorzaakte tumoren in alle muizen.

Dit effect is voornamelijk toe te schrijven aan ‘natural killer’ (NK)-cellen. Indien namelijk 1 dag voor inspuiten van 105 EL4pLJ-IL-2-cellen de NK-cellen van de B6-muizen werden weggevangen (door inspuiting van NK-specifieke monoklonale antistoffen) kregen vrijwel alle muizen wèl een tumor. Bovendien werd het verschil in ontstaan van tumoren ook in naakte T-cel-deficiënte) B6-muizen gevonden. Er lijkt dus geen effecieve T-celreactie tegen de tumorcellen op gang te komen bij en eerste contact met deze cellen.

Indien echter de muizen eerst geïmmuniseerd werden met grote hoeveelheden niet meer delende (bestraalde) EL4pLJ-IL-2-cellen, bleken levende EL4pLJ-cellen niet meer en groeien in deze muizen. Immunisatie met EL4pLJ-cellen is minder effectief. Door middel van in vitro testen is aangetoond dat geïmmuniseerde muizen cytotoxische T-cellen hebben, die EL4-cellen kunnen lyseren. Immunisatie met bestraalde tumorcellen die zelf IL-2 produceren lijkt dus goede bescherming te induceren tegen levende tumorcellen. Geïmmuniseerde muizen bleken echter niet langdurig beschermd. Enkele weken na immunisatie bleken muizen behandeld met bestraalde EL4pLJ-IL-2-cellen niet beter beschermd tegen een injectie met levende EL4-cellen dan muizen behandeld met EL4pLJ-cellen. Er wordt onderzocht of dit komt door een tekort aan IL-2 of door interventie van een regulerend netwerk.

R.A.J.Janssen, D.Th.Sleijfer, A.A.Heijn, R.Brons, N.H.Mulder, H.The en L.H.F.M.de Leij (Groningen), Tijdelijke activering van T-cellen tijdens subcutane recombinant-interleukine-2-therapie bij niercelcarcinoompatiënten weerspiegelt mogelijk het optreden van immunosuppressie

In een immunologisch onderzoek werd de ‘activeringsstatus’ van lymfocyten in perifeer bloed van 18 niercelcarcinoompatiënten bepaald tijdens subcutaan (sc) toegediende recombinant-interleukine-2 (rIL-2)-therapie. De therapie bestond uit 6 cycli van een week, met 5 opeenvolgende dagen waarop rIL-2 werd toegediend en 2 rustdagen. De expressie van de activeringsmerkstoffen ‘human leucocyte, system A’ (HLA)-Dr, CD25 en CD38 op T-helpercellen, cytotoxische T-cellen en ‘natural killer’ (NK)-cellen werd longitudinaal geanalyseerd met behulp van tweekleurenflowcytometrie (‘fluorescence-activated cell sorter’ (FACS)-analyse). Tijdens therapie trad lymfopenie op tijdens rIL-2-toediening en lymfocytose tijdens rustdagen. Deze bevindingen, waartoe ook een sterke toename van het aantal eosinofielen behoort, komen overeen met gegevens uit de literatuur over de invloed van intraveneus toegediend rIL-2. Activering van de verschillende lymfocyt-subpopulaties veranderde gedurende het verloop van de therapie. Tijdens de eerste 2 weken van therapie werd een significant percentage van alle lymfocyt-subpopulaties (30-35 van alle lymfocyten) geactiveerd, terwijl in de daaropvolgende weken vooral de NK-cellen in toenemende mate geactiveerd bleken te zijn (60 van alle NK-cellen was geactiveerd). De ‘activeringsstatus’ van vooral de cytotoxische T-celpopulatie bleek significant verlaagd te zijn tijdens de tweede helft van de therapie. Dit zou een gevolg van immunosuppressie kunnen zijn. De patiënten met een partiële of complete regressie van de tumor na therapie (responders) vertoonden vlak voor het begin van therapie significant grotere aantallen lymfocyten vergeleken met de patiënten met een stabiele of progressieve ziekte (niet-responders). Ook de aantallen geactiveerde cytotoxische T-cellen, T-helpercellen en NK-cellen waren bij de responders significant groter vlak voor het begin van therapie dan bij de niet-responders. Tijdens rIL-2-therapie bleken de patiënten met een respons significant hogere pieken in het aantal geactiveerde T-helpercellen te vertonen dan de patiënten zonder respons. Daarnaast vertoonden de responderende patiënten een toenamegelijk-blijven van het aantal geactiveerde cytotoxische T-cellen van dag 7 tot dag 14 (voortdurende activering), terwijl de niet-responderende patiënten in dezelfde periode een afname (afgebroken activering) lieten zien. Restimulatie van perifere mononucleaire cellen in vitro met rIL-2 (100 ‘Cetus-IL-2-eenheden’ per ml) of met tegen CD3 gericht monoklonaal antilichaam (WT32, 5 ‘supernatant’) liet zien dat cellen afgenomen op dag 7 van therapie een significant lagere expressie van HLA-Dr en CD25 vertoonden na stimulatie dan cellen afgenomen op dag 0 van therapie. Vooral de cytotoxische T-cellen lieten een verlaagde activeringsstatus zien. Deze resultaten tonen dat er tijdens subcutane rIL-2-therapie slechts een tijdelijke activering van T-cellen is, hetgeen zou kunnen duiden op een onderdrukking van de T-celrespons op rIL-2. Preliminaire data uit restimulatie-experimenten laten zien dat deze onderdrukte respons een intrinsieke factor van de T-cel is. Een mogelijke oorzaak hiervan is dat stimulatie met grote hoeveelheden rIL-2 zonder gelijktijdige antigeen-T-celreceptor-interactie zou kunnen leiden tot anergie.

R.A.Maas, M.J.Becker, I.S.Weimar, J.C.de Nooy, H.F.J. Dullens en W.den Otter (Utrecht), Anti-tumoractiviteit van CD4- en CD8-T-lymfocyten na immuuntherapie met interleukine-2 van tumordragende muizen

Uit eerder onderzoek is gebleken dat lokale immuuntherapie met interleukine-2 (IL-2) van muizen met intraperitoneale tumoren zeer effectief kan zijn. Indien muizen op dag 0 worden ingespoten met 2 x 104 SL2-tumorcellen (lymfoom) en behandeld op dag 10-14 met dagelijkse injecties van 20.000 units IL-2, geneest 70 van de muizen. Deze therapie is ook effectief in 3 andere tumormodellen. Na analyse van de cytotoxische effectorcellen die aanwezig zijn in de buikholte blijkt dat CD8-T-lymfocyten de belangrijkste effectorcellen zijn die worden gestimuleerd door therapie met IL-2.

De anti-tumoractiviteit van T-cellen in vivo is bestudeerd in transfer-experimenten. Als effectorcellen werden peritoneale exsudaatcellen (PEC) gebruikt die werden verzameld op de laatste dag van de behandeling met IL-2 (dag 14). Van deze PEC, die waren geïsoleerd uit DBA2-muizen genezen van SL2-lymfoom, waren 2 x 107 in staat 2 x 107 – 5 x 107 SL2-tumorcellen te neutraliseren na transfer naar naïeve DBA2-muizen. Depletie van de T-cellen door toepassing van anti-Thy1 resulteerde in normale groei van de tumorcellen. Depletie van de CD4- of de CD8-T-cellen resulteerde echter slechts in een geringe vermindering van het anti-tumoreffect van de PEC.

Intraveneuze injectie van de PEC veroorzaakte genezing van muizen die 1 of 3 dagen eerder subcutaan waren ingespoten met 105 SL2-lymfoomcellen. Depletie van de CD4- of de CD8-T-cellen veroorzaakte geen vermindering van dit anti-tumoreffect. Depletie van zowel de CD4- als de CD8-T-cellen zorgde echter voor een sterke vermindering van het anti-tumoreffect. Intraveneuze injectie van de PEC beschermde naïeve muizen tegen een intraperitoneale tumor-injectie 3 weken later. Wederom was dit anti-tumoreffect optimaal indien zowel de CD4 als de CD8-T-cellen aanwezig waren. Maar de transfer van PEC zonder CD8-cellen veroorzaakte ook een bescherming van de naïeve muizen.

Geconcludeerd kan worden dat IL-2-therapie zowel CD4-als CD8-T-lymfocyten genereert met een sterk anti-tumoreffect in vivo. De cytotoxische activiteit van de CD8-T-lymfocyten lijkt essentieel voor rejectie van de intraperitoneale tumor, terwijl de CD4-T-cellen essentieel lijken voor de inductie van langdurige immuniteit.

V.Mattijssen, L.Balemans, P.Steerenberg en P.de Mulder (Nijmegen), Immuuntherapie met intratumorale toediening van polyethyleenglycol-gemodificeerd recombinant humaan interleukine-2

Polyethyleenglycol-gemodificeerd recombinant humaan interleukine-2 (PEG-IL-2; EuroCetus, Amsterdam) heeft in vergelijking met niet-gemodificeerd recombinant interleukine-2 (rIL-2) een langere halfwaardetijd en een sterkere anti-tumoreffectiviteit na intraveneuze toediening in diermodellen. Wij evalueerden de waarde van PEG-IL-2 voor loco-regionale immuuntherapie, dat wil zeggen bij toediening direct in de tumorregio. Cavia's met een meetbare ‘line 10’-tumor (een ongedifferentieerd carcinoom) op de flank en micrometastasen in de regionale oksellymfklieren (situatie 7 dagen na tumorinoculatie) werden behandeld met intratumorale (it) en perilymfatische (pl; rondom de drainerende okselklieren) injecties met rIL-2 of PEG-IL-2. PEG-IL-2 toonde significante groeiremming van zowel de primaire tumor als de lymfkliermetastasen bij lagere doseringen (9000 ‘international units’ (IU) per injectie) dan rIL-2 (60.000 IU). Voor PEG-IL-2 bleek toediening 3 x per week optimaal, terwijl rIL-2 slechts een groeiremmend effect gaf bij dagelijkse toediening. Met 60.000 IU PEG-IL-2, it pl, 3x per week gedurende 5 weken werden 4 van de 17 (24) dieren genezen. Hetzelfde schema met 200.000 IU gaf bij 55 (100) curatie. Ook bij deze hoogste geteste dosering waren er geen tekenen van toxiciteit. Genezen dieren bleken resistent tegen een hernieuwde ‘challenge’ met line-10-tumorcellen op de andere flank, hetgeen wijst op de ontwikkeling van een algemene anti-tumoractiviteit. Verder was deze immuniteit overdraagbaar op naïeve dieren door middel van transfusie van miltlymfocyten. De relevantie van de PEG-IL-2-injectieplaats werd onderzocht door in hetzelfde model de injecties òf it òf pl te geven. De it injectie bleek de oorzaak te zijn van het bereikte resultaat, terwijl alleen pl toediening geen effect had, ook niet na chirurgische verwijdering van de primaire tumor op dag 7.

Conclusie

Herhaalde 3-wekelijkse intratumorale PEG-IL-2-injectie op een intermediair dosisniveau resulteert in curatie van een palpabele cavia-line-10-tumor met regionale micrometastasen. Evaluatie van de waarde van deze benadering bij humane tumoren lijkt aangewezen. Hierbij wordt vooral gedacht aan het hoofd-halscarcinoom, waarvan het gebruikte model een redelijke afspiegeling is.

M.R.Bernsen, H.J.J.van Barlingen, H.F.J.Dullens, W.den Otter en A.P.M.Heintz (Utrecht), Immunologische effecten en anti-tumoractiviteit van cisplatine en recombinant interleukine-2 in tumormodellen in de muis

Combinatietherapie met cisplatine en recombinant interleukine-2 (rIL-2) is toegepast in 3 tumormodellen in de muis: DBA2-SL2 (lymfoom), DBA2-P815 (mastocytoom), C3HeBFe-MOT (ovariumteratocarcinoom). Hierbij is de anti-tumorwerking van deze combinatie bestudeerd en zijn effecten van cisplatine op het immuunsysteem bestudeerd. In zowel het SL2-model als het MOT-model resulteert combinatie van cisplatine en rIL-2 in een synergistische anti-tumorwerking. SL2-tumor-dragende muizen die op de 2e dag 1 mgkg cisplatine in de buikholte toegediend krijgen of 5000, 20.000 of 60.000 units (U) rIL-2 op de dagen 10-14, stoten in respectievelijk 6, 0, 9 en 50 van de gevallen de tumor af. Indien deze doseringen rIL-2 gecombineerd worden met 1 mgkg cisplatine nemen deze percentages toe tot respectievelijk 25, 34 en 65.

In het geval van de MOT-tumor induceert noch cisplatine noch rIL-2, indien afzonderlijk toegediend, een anti-tumorrespons die significant verschilt van die bij niet-behandelde dieren. Wordt echter op de 4e dag 5 mgkg cisplatine in de buikholte toegediend gevolgd door injecties met 60.000 U rIL-2 van dag 10-14 en dag 17-21, dan leidt dit tot verlenging van de levensduur van de meeste muizen en zelfs in 13 van de gevallen tot complete afstoting.

In het P815-model resulteert de combinatie van cisplatine en rIL-2 niet in een synergisme wat betreft anti-tumorwerking. Integendeel, toediening van 1 of 2,5 mgkg cisplatine op dag 2 leidt tot een verminderde effectiviteit van rIL-2-therapie toegepast van dag 10-14.

Om meer inzicht te verkrijgen in de mechanismen die aan deze waargenomen effecten ten grondslag liggen, zijn enkele effecten van cisplatine op het immuunsysteem bestudeerd. In zowel het SL2- als het P815-model zijn muizen die genezen ten gevolge van therapie met rIL-2 immuun voor de tumor. Muizen die genezen ten gevolge van behandeling met 1 mgkg cisplatine, al dan niet in combinatie met rIL-2, zijn eveneens immuun. Dit duidt op betrokkenheid van specifieke immunologische mechanismen. Indien een dosis van cisplatine hoger dan 1 mgkg wordt toegepast, neemt het percentage genezen muizen die immuun zijn af met toenemende dosis cisplatine. Hieruit blijkt dat cisplatine de ontwikkeling van immuniteit op een dosisafhankelijke manier beïnvloedt.

C3HeBFe-muizen die MOT-tumor volledig hebben afgestoten blijken niet immuun te zijn. Dit maakt de betrokkenheid van specifieke immuuneffectormechanismen onwaarschijnlijk. De MOT-tumor is echter ook ongevoelig voor zowel ‘natural killer’ (NK)- als ‘lymphokine-activated killer’ (LAK)-activiteit.

De invloed van cisplatine op de cytolytische activiteit van macrofagen afkomstig van DBA2-muizen is eveneens bestudeerd. Uit deze experimenten blijkt dat cisplatine de cytolytische activiteit van macrofagen kan doen toenemen, dit zowel bij naïeve DBA2-muizen als bij SL2- en P815-dragende muizen.

Ten slotte is ook het effect van cisplatine op de samenstelling van de peritoneale lymfocytenpopulatie bestudeerd (CD4CD8-verhouding), maar de resultaten van deze experimenten waren niet eenduidig, zodat dit effect van cisplatine nader onderzocht dient te worden.

L.A.Everse, H.J.A.M.de Jong, H.F.J.Dullens en W.den Otter (Utrecht), Effecten op de tumorgroei van stimulatie van de immunorespons voorafgaande aan de behandeling met lage dosis recombinant interleukine-2

Vergeleken met de behandeling van tumordragende muizen met hoge dosis recombinant interleukine-2 (rIL-2) resulteert behandeling met lage dosis rIL-2 in een groot aantal gevallen in genezing van deze muizen. Bovendien zijn er geen zichtbare toxische neveneffecten. Zoals aangetoond door Maas et al. in het lokaal SL2-DBA2-lymphomamodel zijn T-cellen nodig voor het welslagen van therapie met lage dosis rIL-2.1 Met andere woorden: de therapieresultaten zijn mede afhankelijk van de aanwezigheid van een cellulaire immunoreactie. Dit verklaart ook waarom ‘vroege’ therapie met lage dosis rIL-2 (20.000 Udag, dag 6-10 na tumorinjectie) niet effectief is, terwijl na zogenaamde ‘late’ therapie (dag 10-14 na tumorinjectie) 70 van de tumordragers de ziekte overleeft.

Intussen is gebleken dat de lage-dosistherapie (vroeg dan wel laat) effectiever is bij muizen die op dag 0 niet alleen onbestraalde SL2-cellen, maar tegelijkertijd een hoeveelheid bestraalde SL2-cellen hebben gekregen. Dit effect is specifiek: worden naast SL2-cellen bestraalde P815-mastocytoomcellen geïnjecteerd (in plaats van bestraalde SL2-cellen) dan leidt vroege therapie met rIL-2 niet tot genezing van deze muizen. Preliminaire resultaten wijzen erop dat bij dit fenomeen vooral antigeenpresentatie een belangrijke rol speelt. CD4-T-cellen, geïsoleerd uit muizen immuun tegen SL2, prolifereren sterk in co-kweken met macrofagen geïsoleerd uit muizen die zowel onbestraalde als bestraalde SL2 hebben gekregen. In co-kweken met macrofagen uit muizen die of alleen onbestraalde SL2, of onbestraalde SL2 in combinatie met bestraalde P815 hebben gekregen, prolifereren de CD4-T-cellen minder sterk. Wij veronderstellen dat ten gevolge van de aanwezigheid van bestraalde (niet-delende) cellen relatief snel veel antigeen wordt verwerkt (‘geprocessed’) en gepresenteerd. Dit verklaart waarom CD4-T-cellen uit geïmmuniseerde muizen beter prolifereren in aanwezigheid van macrofagen uit muizen die een mengsel van onbestraalde en bestraalde SL2 hebben ontvangen dan in aanwezigheid van macrofagen uit muizen die of alleen onbestraalde SL2 hebben gekregen of onbestraalde SL2 in combinatie met bestraalde P815. Blijkbaar komt de reactie in een kortere tijd in een stadium waarin behandeling met lage dosis rIL-2 kan resulteren in stimulatie van de in gang zijnde reactie.

W.M.Kast, R.Offringa, I.Meijer, A.Zantema, A.J.van der Eb en C.J.M.Melief (Leiden), Cellen getransformeerd door adenovirus type 5 en het geactiveerde ras-oncogen ontsnappen aan destructie door T-cellen

Muize-embryocellen getransformeerd door het adenovirus-type-5-E1A-gen en het geactiveerde ras-oncogen induceren tumoren in immunocompetente syngene muizen. Dit ondanks het feit dat deze tumorcellen zeer immunogene peptiden expresseren van het E1A-eiwit in de groeve van ‘major histocompatibility complex’ (MHC) klasse I-moleculen en dat deze tumorcellen gevoelig zijn voor adeno-5-E1A-specifieke cytotoxische T-lymfocyten in vitro. Immunotherapie met deze cytotoxische T-lymfocyten bij naakte muizen die tumoren dragen die door adenovirus type 5 zijn geïnduceerd of tumoren dragen die door adenovirus type 5 en het geactiveerde ras-oncogen zijn geïnduceerd, is alleen succesvol bij de eerstgenoemde tumoren. Het vermogen van de door adenovirus type 5 en geactiveerd ras-oncogen getransformeerde cellen om te ontsnappen aan T-celimmuniteit kan mogelijk verklaard worden door de secretie van ‘transforming growth factor ?’, die T-cellen in hun groei remt. Deze mogelijke vorm van ontsnapping aan het immuunsysteem is onderwerp van uitvoerig verder onderzoek en de resultaten daarvan hebben mogelijk een klinische implicatie gezien de betrokkenheid van het ras-oncogen bij humane tumoren.

R.E.M.Toes, R.Offringa, R.J.J.Blom, R.M.P.Brandt, A.J. van der Eb, C.J.M.Melief en W.M.Kast (Leiden), Cellulaire immuniteit tegen door adenovirus type 5-E1 getransformeerde cellen met een veranderd immunodominant epitoop

B6-cellen (H-2b) getransformeerd met het E1-gebied van adenovirus type 5 (Ad 5) zijn tumorigeen bij immunodeficiënte (naakte), maar niet bij immunocompetente muizen. De cytotoxische T-cel (CTL)-kloon 5 is in staat deze tumor bij naakte muizen op te ruimen. Het peptide SGPSNTPPEI, dat herkend wordt door kloon 5 en diverse andere CTL-klonen, kan gezien worden als het immunodominante peptide in deze cellen.

Een mechanisme waardoor een tumorcel kan ontsnappen aan de dodelijke surveillance door CTL's zou de expressie van een gemuteerd immunodominant epitoop kunnen zijn. Ondanks het aanbrengen van een verandering in het immunodominante epitoop van door Ad 5 getransformeerde cellen blijkt echter dat deze cellen niet tumorigeen zijn in immunocompetente muizen. Dit is waarschijnlijk een gevolg van de inductie van CTL's tegen het veranderde epitoop dan wel tegen andere immunorecessieve peptiden. Deze mogelijkheden worden op dit moment nader onderzocht.

K.M.Krüse, S.Osanto en P.I.Schrier (Leiden), Karakterisering van een T-celkloon specifiek voor het niercelcarcinoom

Van een patiënt met een gemetastaseerd niercelcarcinoom werd na nefrectomie uit de niertumor een tumorcellijn gestabiliseerd. Tevens werden tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) in kweek gebracht. Na 3 weken kweken in een hoge concentratie recombinant interleukine-2 (rIL-2; 3000 IUml) werd de TIL-kweek van CD4-positieve cellen geschoond. Vervolgens werden de cellen in aantallen van 3-100 cellen per kweekvaatje verder gekweekt in een lage concentratie IL-2 (120 IUml) met bestraalde tumorcellen als stimulator en een mengsel van lymfocyten en Epstein-Barr-virus (EBV)-cellijnen als ‘feeders’.

De microkweken werden geanalyseerd met een ‘fluorescence-activated cell sorter’ op CD3-, CD4- en CD8-markers. Het lytisch vermogen van de effectors werd bepaald met een 51Cr-‘release assay’ met als ‘targets’ K562, een ‘natural killer’ (NK)- en ‘lymphokine-activated killer’ (LAK)-gevoelige cellijn, de autologe tumor en diverse allogene niertumorlijnen, die in ons lab in kweek waren gebracht.

De meeste kweken bleken voor meer dan 90 te bestaan uit CD8-positieve cellen. Het lytisch patroon bleek echter sterk te variëren. De meeste kweken lyseerden 40-60 van de autologe tumor bij een effector-target-ratio van 25 en steeds bleek de lysis van K562 ongeveer de helft daarvan te bedragen. Enkele kweken lyseerden ook een van de allogene tumoren. Enkele veelbelovende lijnen werden doorgekweekt, waarbij bleek dat de lysis van de K562-cellen snel verloren ging, terwijl de lysis van autologe tumorcellen op ongeveer hetzelfde niveau bleef. Helaas bleek het prolifererend vermogen sterk af te nemen.

Het bleek mogelijk dergelijke kweken opnieuw te activeren door tumorcellen, voorbehandeld met ?-interferon, als stimulators te geven. Met iso-elektrische ‘focusing’ kon worden aangetoond dat de tumor een sterk verlaagd niveau van de ‘human leucocyte, system A’ (HLA)-B-eiwitten (B37 en B44) had, terwijl één van de HLA-A-eiwitten (A23) volledig afwezig was. Hiervan bleek een gendefect de oorzaak te zijn. De expressie van HLA-A1 was normaal. De expressie van HLA-B kon worden verhoogd door incubatie met ?-interferon. Eén van de kweken die goed doorgroeiden na stimulatie werd gekloneerd, waarbij de klonen het lysispatroon van de ouderlijn bleken te vertonen.

Om aan te tonen dat de T-cel de tumor herkent via het ‘major histocompatibility complex’ (MHC)-molecuul werd de target-cel geïncubeerd met monoklonale antistoffen die binden aan het HLA. Na binding van W632, een antistof tegen alle klasse I-moleculen, en na binding van 4E, een antistof die HLA-B-moleculen herkent, bleek de lysis vrijwel volledig geremd te zijn. De lysis van de autologe tumorcellen door de kloon vertoont dus B37- of B44-restrictie. Bij het testen van een groter panel van target-cellen bleek de kloon ook een allogene niertumorcel te lyseren. Deze tumor, getypeerd als A1A2B37B13, brengt alle HLA-eiwitten normaal tot expressie. Mogelijk is de lysis door de T-celkloon HLA-B37- gerestricteerd en presenteren de beide niertumorlijnen een zelfde tumorspecifiek antigeen.

M.C.W.Feltkamp, H.L.Smits, B.M.de Jongh, R.Minnaar, C.J.M.Melief, J.ter Schegget en W.M.Kast (Amsterdam), Het ‘vroege gebied’ van het humane papillomavirus 16 codeert voor verschillende ‘major histocompatibility complex’ (MHC)-klasse I-bindende peptiden

Het humane papillomavirus (HPV) houdt sterk verband met de ontwikkeling van cervixtumoren: 99 van de invasieve plaveiselcelcarcinomen van de cervix is HPV-positief, 65 hiervan HPV16-positief. Omdat HPV16 in deze tumoren mogelijk als tumorspecifiek antigeen kan fungeren, is het belangrijk om de immunorespons tegen dit virus te bestuderen. Daartoe zijn door HPV16 getransformeerde tumorigene cellijnen gegenereerd die een cytotoxische T-lymfocyt (CTL)-respons kunnen opwekken in B6-muizen (haplotype H-2b). Deze CTL-respons is specifiek voor cellijnen die het ‘vroege gebied’ van HPV16 (HPV16-E) tot expressie brengen. Om het precieze epitoop (van HPV16 afgeleid peptide) te vinden dat door deze CTL wordt herkend in de context van ‘major histocompatibility complex’ (MHC)-klasse I-moleculen is een set overlappende synthetische peptiden van HPV16-E gemaakt. Deze peptiden zijn getest op hun vermogen te binden aan MHC-klasse I-moleculen door gebruik te maken van RMA-S-cellen, die lege (dat wil zeggen: er is geen peptide aanwezig in de groeve) MHC-klasse I-Kb- en -Db-moleculen op hun celmembraan dragen. Hieruit blijkt dat HPV16-E codeert voor een twintigtal peptiden die aan Kb of Db kunnen binden. De meerderheid van deze bindende peptiden draagt ook de allel-specifieke peptidemotieven voor Kben Db zoals die beschreven zijn door Falk et al. voor natuurlijk voorkomende peptiden.1 Omdat de gevonden peptiden voldoen aan een belangrijke voorwaarde voor CTL-herkenning, namelijk binding aan MHC-klasse I, zijn dit kandidaat-CTL-epitopen. Deze peptiden zullen daarom getest worden op hun vermogen ‘target’-cellen te sensibiliseren voor onze CTL.

A.J.A.M.Sijts, E.A.M.Mengede, T.J.M.Leupers en C.J.M.Melief (Leiden), Specifieke T-celimmuniteit tegen het muizeleukemievirus MCF1233

Wanneer muizen uit de C57BL10 (B10)- of B6-stam binnen 24 uur na geboorte geïnfecteerd worden met het muizeleukemievirus MCF1233, ontstaan T- en B-cellymfomen in deze dieren. Het verschijnen van de lymfomen is afhankelijk van het H-2-klasse II-I-A-locus van de geïnfecteerde muis. T-cellymfomen ontwikkelen zich voornamelijk in muizen die drager zijn van elk allel anders dan het b-allel op dit locus (zogenaamde I-Anon-b-muizen). B-cellymfomen daarentegen ontstaan zowel in I-Anon-b-muizen, als in muizen die het b-allel op dit locus bezitten. Deze B-cellymfomen vertonen langere latentietijden in laatstgenoemde muizengroep. Het I-Ab-allel biedt dus bescherming tegen de ontwikkeling van door MCF1233 geïnduceerde tumoren. In het huidige onderzoek gebruiken wij I-Ab (B6)-muizen om een door T-cellen gemedieerde afweerreactie tegen het MCF1233-muizeleukemievirus op te wekken. Volwassen B6-muizen worden herhaaldelijk geïmmuniseerd met door MCF1233 getransformeerde B-celtumoren die de voor T-celherkenning benodigde eiwitten, namelijk H-2-klasse I en virale MCF1233-eiwitten, sterk expresseren. De miltcellen van deze muizen worden 3 weken na de eerste immunisatie verwijderd en in kweek genomen. Resulterende kweken bevatten voornamelijk cytotoxische T-lymfocyten (CTL's), die door MCF1233 getransformeerde B-cellymfomen lyseren in functionele tests. Ze herkennen dus door het MCF1233-virus gecodeerde sequenties. De bedoeling is nu om de exacte virale eiwitsequenties (peptiden) die door deze T-cellen herkend worden te bepalen. Analyse van ‘target’-celherkenning door uit ‘limiting dilution’ verkregen CTL-klonen duidt aan dat waarschijnlijk meerdere peptiden een rol spelen. Deze peptiden kunnen zowel van het virale kerneiwit, gag, als van het virale envelopeiwit afkomstig zijn.

Literatuur
  1. Hekman A, Honselaar A, Vuist WM, et al. Initial experiencewith treatment of human B cell lymphoma with anti-CD19 monoclonal antibody.Cancer Immunol Immunother 1991; 32: 364-72.

  2. Maas RA, Weering DHJ van, Dullens HFJ, Otter W den.Intratumoral low-dose interleukin-2 induces rejection of distant solidtumour. Cancer Immunol Immunother 1991; 33: 389-94.

  3. Falk K, Rotzschke O, Stevanovic S, Jung G, Rammensee HG.Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted fromMHC molecules. Nature 1991; 351: 290.

Auteursinformatie

NKB-NWO-Deelwerkgemeenschap Tumorimmunologie, pa Het Nederlands Kanker InstituutAntoni van Leeuwenhoek Huis, Plesmanlaan 121, 1066 CX Amsterdam.

Prof.dr.C.G.Figdor, secretaris.

Gerelateerde artikelen

Reacties