Van Miescher tot moleculaire DNA-technologie; een hoofdstuk uit de medische geschiedenis van de afgelopen eeuw

Perspectief
F.T. Bosman
Citeer dit artikel als
Ned Tijdschr Geneeskd. 1999;143:2009-14
Abstract
Download PDF

Samenvatting

Hoewel de moleculaire biologie een jonge discipline is, vindt ze haar oorsprong in de tweede helft van de 19e eeuw met de gelijktijdige ontdekking van de wetten van de erfelijkheid door Mendel en van nucleïnezuur door Miescher. Pas rond 1950 werd de structuur van DNA opgehelderd en werd bewezen dat DNA voor de erfelijke eigenschappen verantwoordelijk is. Hierna volgden de ontwikkelingen elkaar in snel tempo op met de ontrafeling van de erfelijke code, de opheldering van het mechanisme van de vertaling van DNA in eiwitten, de ontdekking van de structuur van genen en de vondst van de methoden voor genetische manipulatie. Voor de ontwikkeling van de moderne biotechnologie zijn deze essentieel gebleken.

artikel

We zitten midden in een moleculair-biologische revolutie. De laatste 10 jaar neemt de kennis van de moleculaire basis van de genetica explosief toe en de bijbehorende technologie - half oorzaak, half gevolg van die kennis - heeft een merkbare invloed op het leven van alledag. Transgene planten worden gekoesterd door de een en verguisd door de ander. Recombinant erytropoëtine beroert de wielrennerij. Transgene xenotransplantaten vormen een potentiële oplossing voor een orgaantekort, maar ook een ethisch dilemma. De therapie van morgen heeft genen als doelwit. Welke ontwikkelingen hebben tot die situatie geleid? Hoe zijn we zo ver gekomen?

de chemische samenstelling van de celkern

Moleculaire biologie is een relatief jonge discipline. Men zou die kunnen laten beginnen in 1953 met de opheldering van de structuur van het DNA-molecuul door James Watson en Francis Crick (‘DNA’ is de afkorting van ‘deoxyribonucleic acid’).1 In feite is chemisch onderzoek van de celkern en van de erfelijkheid echter heel wat ouder.

Nucleïne

De ontrafeling van de moleculaire structuur van de celkern begon eigenlijk meer dan honderd jaar geleden met de ontdekking, in 1869, van nucleïnezuren door Johann Friedrich Miescher in Basel. Hij isoleerde uit celkernen (hij gebruikte als grondstof pus uit wondverband) een stof waarvan de eigenschappen niet overeenkwamen met die van eiwitten en noemde de stof nucleïne. Men realisere zich dat op dat moment de heersende opvatting was dat eiwitten verantwoordelijk zijn voor de overdracht van erfelijke eigenschappen.

Allelen

Het is een historisch toeval dat in dezelfde tijd Gregor Mendel de grondwetten van de erfelijkheid herkende en in twee artikelen publiceerde - in 18652 en in 1869. Uit zijn experimenten met erwten bleek dat bastaarden van voor een bepaald kenmerk raszuivere ouders in de eerste generatie altijd gelijk waren. De tweede generatie bleek echter voor dit kenmerk heterogeen. Mendel stelde ook vast dat één van de ouderlijke kenmerken altijd dominant was. In moderne termen: er zijn 2 allelen per gen, van elke ouder één; het ene allel is recessief en het andere dominant. Van dit mechanisme had Mendel nog geen notie. Genetica bestond nog niet; de term werd pas in 1905 voor het eerst gebruikt (door Bateson). Het zou nog 20 jaar duren tot Waldeyer aan chromosomen hun naam gaf en Van Beneden in Leuven ontdekte dat geslachtscellen de helft van het aantal chromosomen van de bevruchte cel bevatten. Het duurde tot 1920 voordat Thomas Hunt Morgan aantoonde dat genen (een term die in 1909 door de Deense geneticus Wilhelm Johannsen was geïntroduceerd) op chromosomen liggen.

Nucleïnebasen

De analyse van de aard van het door Miescher beschreven nucleïne vorderde gestaag. Rond 1900 was duidelijk geworden dat het een lang molecuul was met tenminste 3 bouwstenen: een desoxyribosesuiker, fosforzuur en een stikstofrijke base. De Duitser Kossel had de structuur van de basen ontrafeld en noemde ze adenine (A), thymine (T), guanine (G) en cytosine (C); later kwam daar nog uracil (U) bij. Kossel veronderstelde dat de 4 eerstgenoemde basen in equimolaire hoeveelheden in nucleïnezuur aanwezig zijn; deze ‘tetranucleïnezuurhypothese’ hield tot ongeveer 1950 stand, mede door de fervente steun van de gezaghebbende chemicus Phoebus Levine van het Rockefeller Institute in New York, die DNA beschouwde als een monotoon regelmatig polymeer. Bij de vergelijking van nucleïnezuur van verschillende species vond de groep van Erwin Chargeff in de Columbia Universiteit echter dat de hoeveelheid A altijd gelijk was aan de hoeveelheid T, en de hoeveelheid G aan de hoeveelheid C, maar dat de verhouding A-T : G-C sterk kon verschillen van soort tot soort. Deze bevinding bracht hen op het idee van de complementariteit van de basen.

Eiwit of DNA?

Chemici met belangstelling voor de celkern en erfelijkheidsbiologen werkten grotendeels onafhankelijk van elkaar. Tot de laatste categorie behoorden Oswald Avery en medewerkers, ook in het Rockefeller Institute, die het mechanisme van de verschillen in virulentie van verschillende pneumokokkenstammen onderzochten. Laagvirulente pneumokokken konden zij transformeren met een bacterieel extract dat niet gevoelig was voor behandeling met trypsine, chymotrypsine en RNase; het was echter niet meer transformerend na behandeling met DNase. De conclusie, die zij publiceerden in 1944,3 was dat de substantie die zij verantwoordelijk achtten voor transformatie ‘in essentie, zo niet exclusief, uit zeer zuiver gepolymeriseerd visceus desoxyribonucleïnezuur’ bestond. Voor het eerst werd hiermee onomwonden gesteld dat niet eiwitten erfelijke eigenschappen veroorzaken, maar dat DNA hiervoor verantwoordelijk is. Het belang van deze boodschap drong echter niet meteen door. Eiwitten, met als ‘alfabet’ een twintigtal aminozuren, leken nog steeds heel wat intelligenter dragers voor een genetische code dan het simpele DNA met slechts 4 basen als ‘letters’.

Bacteriofagen

Onderzoek naar het reproductiemechanisme van virussen leverde uiteindelijk het bewijs dat DNA de drager is van de genetische informatie.4 Dit onderzoek werd vooral gedaan aan bacteriofagen, die rond 1915 door de Canadees Felix d'Hérelle waren ontdekt als virussen die bacteriën kunnen infecteren. Hoe fagen dat doen, werd opgehelderd door Max Delbrück en Salvador Lucia, Europeanen die nazi-Duitsland waren ontvlucht, en Alfred Hershey in Cold Spring Harbor in New York. Dit driemanschap kan beschouwd worden als grondlegger van de moleculaire biologie. De Cold Spring Harbor-conferenties, die rond de groep ontstonden, staan nog steeds in zeer hoog aanzien bij moleculair-biologen. Voor het beantwoorden van de vraag hoe fagen zich vermenigvuldigen in bacteriën zochten de onderzoekers naar het genetische materiaal van het virus. In een beroemd geworden experiment toonden Hershey en zijn medewerkster Margaret Chase in 1953 aan dat als bacteriën worden geïnfecteerd met fagen waarvan de eiwitcapside met 35S is gemerkt of met fagen waarvan het DNA met 32P is gemerkt, alleen het 32P in de geïnfecteerde bacteriën is terug te vinden.5 Spoedig realiseerde men zich dat DNA de gezochte substantie moest zijn. Voor dit werk kreeg de faaggroep in 1969 de Nobelprijs.

de dubbele helix

Zo zag het veld er dus omstreeks 1955 uit. DNA was geidentificeerd als drager van de genetische informatie, de basen als bouwstenen van DNA waren bekend en basenparing was herkend. Van de ruimtelijke structuur van DNA had echter niemand enige notie. Röntgendiffractieonderzoek bleek hier essentieel. Hoewel de techniek en de mathematische basis voor de interpretatie van de diffractiebeelden in een moleculaire structuur al in 1912 waren ontwikkeld, duurde het tot in 1934 voordat Bernal in Cambridge een groot organisch molecuul (pepsine) met deze techniek onderzocht. In het laboratorium van Linus Pauling in het California Institute of Technology werd in 1951 de ?-helix ontdekt als structuur van sommige polypeptiden. Maurice Wilkins en Rosalind Franklin, medewerkers van Watson en Crick in Cambridge, slaagden er als eersten in bruikbare röntgendiffractiebeelden van DNA te vervaardigen. De beelden duidden ook op een helixstructuur. Met deze uitgangspunten, de helix, de lineaire fosfaat-suikerketen en de basencomplementariteit togen Watson en Crick aan het werk, dat eerst het knippen en plakken van papieren modellen omvatte en vervolgens de montage van metalen modellen. Een bekende foto toont de jeugdig ogende geleerden rond een manshoog model van hun geesteskind (figuur 1). De door hen voorgestelde structuur was van een verbluffende eenvoud; ze werd vastgelegd in een klassiek Nature-artikel in 19536 en leverde hen in 1962 de Nobelprijs op. Het moet, ook voor nuchtere wetenschappers, een bijzondere tijd zijn geweest. Watson schreef in zijn boek The double helix, dat in 1968 verscheen,7 dat hij het gevoel had de bijbel te herschrijven; het onderzoek raakte volgens hem de oorsprong van het leven.

de vertaalslag

Nu de structuur van het DNA was opgehelderd en de dubbele helix met de gepaarde basen ook het antwoord had gegeven op de vraag naar het mechanisme van de semi-conservatieve replicatie, bleef de brandende vraag hoe de 4 letters van het DNA-alfabet de informatie verschaffen die de volgorde van zo'n 20 aminozuren bepaalt. Aan het eind van de jaren vijftig zat het idee in de lucht dat een combinatie van basen de code moest bevatten voor de aminozuurvolgorde. Het was Crick die op het idee kwam van de tripletcode. Hij postuleerde dat de basenvolgorde in DNA en de aminozuurvolgorde in eiwitten colineair zijn. De genetische code moest derhalve lineair zijn opgeslagen in het DNA-molecuul. Verder stelde hij dat de in DNA besloten informatie via een intermediair RNA-molecuul in eiwit wordt vertaald - lange tijd een centraal dogma in de moleculaire biologie. Bewijzen voor de stellingen van Crick kwamen uit onderzoek naar mutaties in bacteriën en fagen, waaruit bleek dat puntmutaties inderdaad leidden tot aminozuurveranderingen in het gecodeerde eiwit.

Codon

In 1961 stelden Crick en Brenner dat de genetische code moest bestaan uit drieletterige nucleotidesequenties, die zij ‘codon’ doopten. In celvrij translatieonderzoek werd vervolgens de tripletcode gekraakt. Hoewel de stellingen van Crick voor deze fase van het onderzoek wezenlijk waren, bleken ze alras te rigide. Sommige organismen gebruiken namelijk RNA als drager van de genetische code. Niet-coderende nucleïnezuursequenties en elkaar overlappende leesramen binnen één gen zetten het concept van de colineariteit van DNA en eiwit op de tocht.

Transcriptie en translatie

Nu het duidelijk was hoe het zat met de code, rees natuurlijk de vraag hoe de code vertaald wordt in feitelijke aanmaak van eiwitten. RNA was intussen in de jaren vijftig geïdentificeerd in ribosomen. Dat RNA ook genetische informatie draagt, was duidelijk geworden uit het bestaan van RNA-virussen. Aanvankelijk bestond het idee dat ribosomaal RNA de informatie voor de aminozuurvolgorde als een soort matrijs bevat. Dit idee kon in het onderzoek niet worden bevestigd. De doorbraak kwam hier uit Parijs, waar in het Institut Pasteur François Jacob en Jacques Monod een instabiel RNA postuleerden dat als ‘boodschapper’ zou fungeren. De bevestiging van deze hypothese is een vroeg voorbeeld van internationale samenwerking in het onderzoek. Discussie tussen Jacob en de Crick-groep in Cambridge leidde tot een serie experimenten in de eerdergenoemde faaggroep, waar de ontdekking van boodschapper-RNA (‘messenger’-RNA, mRNA) het resultaat van was. Watson, die in 1960 naar Harvard was vertrokken om een nieuw instituut voor moleculaire biologie te leiden, ontdekte mRNA tegelijkertijd. Uit dit onderzoek bleek ook dat het ribosoom voor de eiwitsynthese de rol speelt van, zoals Crick het uitdrukte, ‘de leeskop in een bandrecorder’.

knippen en plakken

Met de opheldering van de structuur van het DNA en de principes van transcriptie via RNA was het inzicht in de moleculaire basis van het leven weliswaar spectaculair verdiept, maar de complexiteit van de materie bleek weldra groter dan voorzien. Sharp ontdekte in 1977 in zijn onderzoek aan adenovirussen dat het aantal basen in het DNA van een bepaald gen groter was dan het aantal in het bijbehorende mRNA. Min of meer tegelijkertijd werd dit ook voor andere organismen gevonden door onder meer Flavell in Amsterdam. Genen bleken een mozaïekstructuur te hebben, waarin coderende sequenties (de exons) worden afgewisseld door niet-coderende sequenties (de introns). Het werd duidelijk dat bij het vertalen van genomisch DNA naar een functioneel mRNA-molecuul rijp mRNA ontstond door knippen en plakken van een voorloper-mRNA-molecuul. Deze waarnemingen leidden een belangrijk besef in: niet alle DNA in de celkern is coderend. Naar naderhand bleek, is zelfs 80-90 van het kern-DNA niet coderend. Dat komt echter slechts ten dele door introns. Een zeer substantieel deel van het DNA blijkt uit zogenaamde repeterende sequenties te bestaan - reeksen basen (van slechts 2 tot wel tientallen nucleotiden lang) die een (soms groot) aantal malen worden herhaald. De functie van het repetitieve DNA is nagenoeg onbekend. Datzelfde geldt eigenlijk ook voor de intronsequenties. Wel is duidelijk geworden dat met deze knip- en plakbewerking van voorloper-mRNA een zekere flexibiliteit beschikbaar is: van sommige genen worden exons via meerdere modellen aan elkaar geplakt (zogenaamde ‘alternate splicing’), wat leidt tot de mogelijkheid één gen voor meerdere verschillende (weliswaar homologe) eiwitten te laten coderen.

Restrictie-enzymen

Wie nadenkt over dat knippen en plakken wordt algauw getroffen door de complexiteit van het proces. De sequentie die de intron-exonovergang bepaalt moet worden herkend door een knipmechaniek, en een heel specifiek plakmechaniek dient in staat te zijn van het geheel de moleculaire integriteit te herstellen. Die ‘knippers’ zijn in de ontwikkeling van de DNA-technologie van doorslaggevende betekenis gebleken. Werner Arber kreeg voor de ontdekking van de knippende eiwitten (de restrictie-enzymen), samen met Hamilton Smith en Daniel Nathans,8 in 1978 de Nobelprijs. Restrictie-enzymen zijn endonucleasen, dat wil zeggen dat ze binnen een DNA-molecuul knippen, in tegenstelling tot exonucleasen, die DNA-moleculen aan het eind afbreken. De in de moleculaire genetica en biotechnologie gebruikte restrictie-enzymen knippen op een voorspelbare en consistente plaats. Ze scannen als het ware het DNA-molecuul en doen hun werk als ze een specifieke nucleotidesequentie tegenkomen. Er zijn inmiddels meer dan 1000 verschillende restrictie-enzymen beschreven die meer dan 150 verschillende nucleotidesequenties herkennen. Uitermate nuttig in de recombinant-DNA-technologie zijn de restrictie-enzymen die niet ‘stomp’ knippen, maar een enkelstrengsstukje creëren (figuur 2). Twee van die ‘overhangende’ complementaire enkelstrengsuiteinden kunnen door moleculaire hybridisatie opnieuw een dubbele streng vormen; ze zijn als het ware plakkerig (‘sticky’). Op dit principe is een belangrijk stuk van de recombinant-DNA-technologie gebaseerd, waarop ik verderop terugkom.

gereedschap van de ‘moleculaire technoloog’

Voor de ontcijfering van genetische codes zijn technieken om efficiënt en nauwkeurig de basenvolgorde van een stuk DNA te bepalen essentieel. Een techniek die gebruikmaakt van enzymatische modificatie van nucleotiden werd in 1975 ontwikkeld door Maxam en Gilbert.9 De ook nu nog nagenoeg universeel gebruikte ‘chain termination’-techniek werd in 1977 ontwikkeld in de laboratoria van de Medical Research Council in Cambridge door Fred Sanger,10 die voor dit werk met Maxam en Gilbert de Nobelprijs ontving. De techniek is gebaseerd op de onmogelijkheid voor een DNA-polymerase om de DNA-synthese op een matrijs van enkelstrengs-DNA voort te zetten als in plaats van een normaal nucleotide een dideoxynucleotide door het polymerase wordt aangetroffen. Deze eigenschap van dideoxynucleotiden ligt ook ten grondslag aan hun toepassing als antivirusgeneesmiddel. Voor de sequentiebepaling wordt een dideoxy-A, -T, -G of -C in een verhouding van bijvoorbeeld 1:100 ten opzichte van het normale nucleotide aan de DNA-synthesereactie toegevoegd, evenals een radioactief gemerkt nucleotide. Dideoxynucleotiden worden op willekeurige plaatsen ingebouwd in plaats van hun normale tegenhangers, waardoor de synthese stopt. De gesynthetiseerde fragmenten worden elektroforetisch gescheiden en door autoradiografie zichtbaar gemaakt. Dit leidt tot een ladderpatroon dat eenvoudig is af te lezen (figuur 3). De techniek wordt veelvuldig gebruikt in kleinschalig sequentieonderzoek. Toepassing van fluorescerende merkstoffen heeft het mogelijk gemaakt de techniek in hoge mate te automatiseren. Die automatisering is essentieel voor grootschalige sequentiebepaling, zoals nodig is voor het humaangenoomproject dat in 1988 onder directie van James Watson van start ging.

Polymerasekettingreactie

Een uitermate belangrijk moment in de ontwikkeling van de DNA-technologie was de uitvinding van de polymerasekettingreactie, alom bekend als PCR. In haar huidige vorm werd deze techniek beschreven door Keith Mullis in 1987.11 De moleculair-biologische basis voor de techniek, de verlenging van een stukje start-DNA dat wordt gehybridiseerd op een enkelstrengsmatrijs door DNA-polymerase (de zogenaamde ‘primer extension’), was al in de jaren zestig gelegd. Voor een kettingreactie is de denaturatiestap, het scheiden van de twee complementaire DNA-strengen door hoge temperatuur, essentieel, maar dit leidde tot inactivatie van het DNA-polymerase, dat gevoeglijk voor elke volgende synthesestap opnieuw diende te worden toegevoegd. Mullis bedacht het gebruik van een DNA-polymerase die niet geïnactiveerd wordt door hoge temperatuur. Hiervoor werd het zogenaamde Taq-polymerase gekozen, een enzym afkomstig uit een bacterie (Thermus aquaticus) die in hete bronnen huist. Zo werd een kettingreactie mogelijk zonder dat tussentijds de samenstelling van het reactiemengsel hoefde te worden aangepast. Voor deze vondst werd Mullis in 1993 de Nobelprijs toegekend.

Recombinant-DNA-technologie

De basis voor recombinante DNA-technieken werd gelegd door de groep van Paul Berg in Stanford, vroeg in de jaren zeventig.12 Berg en zijn medewerkers knipten met het restrictie-enzym EcoRI het DNA van het SV40-virus en het circulaire plasmide-DNA van Escherichia coli. In beide DNA's is slechts één knipplaats voor EcoRI aanwezig en bovendien maakt dit enzym de reeds eerder genoemde ‘sticky ends’. De complementaire sticky ends vonden elkaar, zodat Berg in het mengsel van de twee ‘geknipte’ DNA's na ‘plakken’ van de fragmenten met DNA-ligase weer een circulair DNA terug had, maar nu met een combinatie van SV40 en plasmide-DNA (figuur 4). Berg kon zijn experiment echter niet afmaken: grote bezorgdheid over potentiële risico's van genetische manipulatie leidden tot een moratorium, dat hem verbood te bezien of het recombinante gen in een cel kon worden gebracht, daar behouden bleef en kon worden gerepliceerd. Dit experiment werd in 1973 wel uitgevoerd door Stanley Cohen en Annie Chang in Stanford. Zij bewezen dat een recombinant DNA-molecuul kan worden vermenigvuldigd in E. coli.13 Een directe toepassing van de experimenten is de productie van recombinante eiwitten in een therapeutisch kader. Het eerste recombinante peptide dat werd geproduceerd in E. coli was somatostatine. De hiervoor door Itakura en zijn groep gebruikte methode werd in 1980 gepatenteerd.14 Het momenteel ter beschikking staande arsenaal aan recombinante eiwitten loopt in de duizenden. De ontwikkeling van de gentransfermethodologie in eukaryote cellen verliep bijna parallel. Palmiter en Brinster maakten in 1981 hun ‘supermuis’ wereldkundig:15 zij brachten het gen voor rattengroeihormoon in gefertiliseerde muizenoöcyten, implanteerden deze in zwangere muizen en verkregen zo muizen die veel sneller groeiden dan hun normale soortgenoten en inderdaad sterk verhoogde bloedspiegels van groeihormoon vertoonden.

besluit

Het humaangenoomproject, de bepaling van de sequentie van het hele menselijke genoom, gaat heel wat sneller dan oorspronkelijk voorzien dankzij de eerder aangehaalde explosieve ontwikkeling in de moleculaire biologie. Wie de indruk mocht hebben dat daarmee de moleculaire biologie zichzelf aan het opheffen is, vergist zich. Chemisch zal dan het genoom inderdaad gekarakteriseerd zijn, maar in termen van begrip van de functionele rol van die ongeveer 100.000 genen begint het onderzoek eigenlijk pas. De moleculaire biologie staat aan het begin van een spectaculaire ontwikkeling die onze kennis van ziekte, en daarmee ook de mogelijkheid tot diagnostisch en therapeutisch handelen, fundamenteel zal veranderen.

Literatuur
  1. Kendrew JC. The thread of life. Cambridge, Mass.: HarvardUniversity Press; 1966.

  2. Mendel G. Versuche über Pflanzen-Hybriden. VerhNaturforschung Ver Brünn 1865;4:3-37.

  3. Avery OT, MacLeod CM, McCarty M. Studies on the chemicalnature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. J ExpMed 1944;79:137-58.

  4. Cairns J, Stent GS, Watson JD, editors. Phage and theorigins of molecular biology. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring HarborLaboratory; 1966.

  5. Hershey AD, Chase M. Independent functions of viralprotein and nucleic acid in growth of bacteriophages. J Gen Physiol1977;36:39-56.

  6. Watson JD, Crick FHC. Molecular structure of nucleicacids. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature1953;171:964-7.

  7. Watson JD. The double helix. New York: Atheneum;1980.

  8. Nathans D, Smith HO. Restriction endonucleases in theanalysis and restructuring of DNA molecules. Ann Rev Biochem1975;44:273-93.

  9. Maxam AM, Gilbert W. A new method for sequencing DNA. ProcNatl Acad Sci USA 1977;74:560-4.

  10. Sanger F. Determination of nucleotide sequences in DNA.Science 1981;214:1205-10.

  11. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitrovia a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol1987;155:335-50.

  12. Berg P. Dissections and reconstructions of genes andchromosomes. Science 1981;213:296-303.

  13. Cohen SN, Chang ACY, Boyer HW, Helling RB. Constructionof biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad SciUSA 1973;70:3240-4.

  14. Itakura K, Hirose T, Crea R, Riggs AD, Heyneker HL,Bolivar F, et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesizedgene for the hormone somatostatin. Science 1977;198:1056-63.

  15. Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE, Trumbauer ME,Rosenfeld MG, Birnberg NC, et al. Dramatic growth of mice that develop fromeggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature1982;300:611-5.

Auteursinformatie

Prof.dr.F.T.Bosman, patholoog, Institut Universitaire de Pathologie, Rue du Bugnon 25, CH-1011 Lausanne, Zwitserland.

Gerelateerde artikelen

Reacties