Materialen van de moleculaire genetica

Klinische praktijk
J.P.M. Geraedts
Citeer dit artikel als
Ned Tijdschr Geneeskd. 1987;131:2120-3
Download PDF

Inleiding

Vanaf het begin van de jaren zeventig is er grote vooruitgang geboekt op het terrein van de moleculaire genetica. De opheldering van nieuwe subcellulaire structuren en van functies bij micro-organismen leidde in het laboratorium tot methoden om natuurlijke processen na te bootsen. Het onderzoek kwam in een stroomversnelling doordat het mogelijk werd DNA-fragmenten van verschillende soorten aan elkaar te koppelen tot zogenaamde recombinant-DNA-moleculen. Is één van de fragmenten die samengevoegd worden een vector (die vermenigvuldigd kan worden in een gastheercel, zoals een plasmide in een bacterie), dan ontstaat de mogelijkheid het ingebouwde DNA-fragment te vermenigvuldigen. Bij dit proces (moleculaire clonering genaamd) wordt uitgegaan van één cel waarin zich de (recombinante) vector bevindt. Door ongeslachtelijke vermenigvuldiging ontstaan vele genetisch identieke nakomelingen.

Dit artikel bespreekt de biologische materialen die nodig zijn in dit onderzoek. Allereerst betreft dit de beide onderdelen van het recombinant-DNA-molecuul: de vector en het te cloneren genetische materiaal van de mens. Vervolgens komt de gastheer aan de orde en passeren een aantal enzymen de revue. Tenslotte wordt kort aangeduid met welke moleculen bepaalde genen opgespoord kunnen worden. Deze zogenaamde probes hebben meestal een biologische herkomst, maar kunnen tegenwoordig ook volledig gesynthetiseerd worden.

In het tweede artikel komen enkele methoden aan de orde, zoals toegepast bij de moleculaire clonering en gebruikt voor het in kaart brengen van het genoom, de analyse van de structuur en functie van genen, en de diagnostiek van (erfelijke) afwijkingen op DNA-niveau. Veel van de besproken technieken nemen ook een centrale plaats in bij de produktie van belangrijke eiwitten en de eventuele correctie van afwijkingen op DNA-niveau (gen-therapie).

Het genoom van de mens

De genetische informatie die ligt opgeslagen in de 46 chromosomen van de mens is identiek voor iedere cel van een individu. Ofschoon de chromosomen sterk verschillen in grootte, bevatten ze alle slechts één DNA-macromolecuul, dat verbonden is met een complex van eiwitten. Het verschil in grootte wordt veroorzaakt door het aantal nucleotiden, waaruit ieder molecuul is opgebouwd. Nucleotiden zijn de bouwstenen van de DNA-ketens en bevatten naast een suiker- en een fosforgroep, een stikstofbase. Het DNA is aanwezig als een dubbele helix. Deze structuur is mogelijk doordat twee complementaire polynucleotideketens bij elkaar gehouden worden door waterstofbruggen tussen de baseparen adenine en thymine of guanine en cytosine. Het totale genoom van de mens bevat niet minder dan 3 x 109 baseparen. Een gen van 999 basen kan vanwege de tripletcode van het DNA de genetische informatie bevatten van een eiwit dat 333 aminozuren lang is. In het genoom zouden dan ook enkele miljoenen coderende sequenties aanwezig kunnen zijn. Er zijn echter meerdere redenen om aan te nemen dat de mens niet meer dan ongeveer 50.000 verschillende genen heeft. Deze zijn in de meeste gevallen groter dan de veronderstelde lengte van één kilobase vanwege de aanwezigheid van nietcoderende sequenties (introns) tussen de nucleotidenvolgorden die wel worden afgelezen. Maar dan nog is er een grote overmaat aan DNA, die tot gevolg heeft dat de verspreid liggende genen en genfamilies omgeven zijn door basevolgorden waarvan de functie nog moet worden opgehelderd.

Het is bekend dat lang niet al deze sequenties uniek zijn. Er zijn meerdere soorten ‘repetitief DNA’, waarin bepaalde volgorden één tot vele malen herhaald kunnen voorkomen. Bijna de helft van het DNA is in deze vorm aanwezig. Er zijn repetitieve sequenties die een coderende functie hebben, zoals het ribosomale DNA. De overgrote meerderheid heeft echter wellicht een structurele of mechanische functie. De bekendste hier zijn de satelliet-DNA's die in de centromeerregio's zijn gelokaliseerd en mogelijk een beschermende functie hebben tijdens de deling wanneer de spoeldraden moeten aanhechten. Hierbij, maar ook in de chromosoom-armen tussen de structurele genen komen repetitieve nucleotidenvolgorden voor.

Er zijn twee niveaus waarop het genoom doorgaans wordt onderzocht: het moleculaire en het chromosomale. Het is illustratief te bedenken dat met moderne lichtmicroscopische methoden chromosoomafwijkingen kunnen worden vastgesteld die zich beperken tot iets minder dan 1 pro mille van het genoom. De bestudering van dezelfde hoeveelheid materiaal op DNA-niveau is in de regel onbegonnen werk, daar het gemiddeld gaat om enige miljoenen baseparen waarin 50 genen liggen.

Vectoren

Bij de moleculaire clonering tracht men zeer grote aantallen kopieën van een gen (fragment) of een ander DNA-fragment zuiver in handen te krijgen. Dit kan gebeuren doordat het gewenste DNA zich in een gastheercel laat vermenigvuldigen. Een voorwaarde hiervoor is dat het bewuste DNA wordt ingebouwd in een chromosoom of een andere structuur die tot replicatie in staat is (zoals een plasmide). Hiertoe zal men het stuk DNA in vitro in een cloneringsvector inbouwen en vervolgens in de gastheercel manipuleren (figuur 1). Om goed te kunnen functioneren dienen de vectoren te voldoen aan een aantal criteria:

1. Ze dienen het vermogen te hebben de gastheercel binnen te dringen.

2. Ze moeten het eigen genoom en het ingebouwde DNA-fragment autonoom kunnen repliceren.

3. De aanwezigheid van de vector die recombinant-DNA bevat in de gastheercel moet aangetoond kunnen worden.

De grootte van het te cloneren fragment en de doelstelling van het onderzoek bepalen de keuze van een vector uit één van de volgende groepen: plasmiden, (bacteriële) virussen en cosmiden.

Plasmiden

Dit zijn extrachromosomale genetische elementen die een eenvoudig genoom hebben. Ze voldoen aan de bovengenoemde eisen en hebben daarnaast als voordelige eigenschap, dat het DNA gemakkelijk geïsoleerd kan worden vanwege het lage molecuulgewicht. Ze zijn doorgaans uitermate goed selecteerbaar vanwege een aantal ingebouwde kenmerken.

Een bekende cloneringsvector is het plasmide pBR322. Dit 4362 baseparen grote plasmide bevat als selecteerbare kenmerken resistentiegenen voor de antibiotica ampicilline en tetracycline (figuur 2). In het circulaire molecuul zijn knipplaatsen voor de meest gebruikte restrictie-enzymen gelegen waardoor het te cloneren DNA gemakkelijk ingebouwd kan worden. De vreemde DNA-fragmenten mogen echter niet te groot zijn. De bovengrens ligt ongeveer bij 10 kilobasen (kb). Daarboven repliceren de plasmiden niet meer goed en bovendien gaat de transformatie-efficiëntie (de mate waarin ze in staat zijn de gastheercel binnen te dringen) dan sterk achteruit. Fragmenten van 10 kb zijn meestal te klein voor eukaryotische genen die veel introns bevatten. Deze kunnen beter gecloneerd worden in bacteriofagen of cosmiden.

Bacteriofagen

Van het grote aantal bacteriofagen zijn vooral twee Escherichia coli-fagen belangrijk: ? en M13. Faag ? is een dubbelstrengs DNA-virus met een lineair genoom van ongeveer 50 kb. In de gastheer kan het genoom de vorm van een cirkel aannemen. In het midden iseen gebied gelegen dat zonder functieverlies vervangen kan worden door vreemde fragmenten die niet veel groter zijn dan 20 kb. Faag M13 heeft een genoom van slechts 6047 nucleotiden. Van deze kleine faag is een serie cloneringsvectoren afgeleid voor het opkweken van DNA-fragmenten ten behoeve van sequentie-analyse.

Het voordeel van deze vector is dat het rijpe virusdeeltje enkelstrengs DNA bevat, hetgeen het noodzakelijke uitgangsmateriaal is voor een bepaalde efficiëntie-analysemethode.

Cosmiden

Dit zijn vectoren die speciaal geconstrueerd zijn voor de clonering van grote stukken DNA. De gunstige eigenschappen van pBR322 zijn gecombineerd met de twee korte stukjes genoom van faag ?, die nodig zijn voor de opname van het recombinant-DNA in de kop van de faag.

Virussen

Behalve van bacteriofagen wordt nog weinig van virussen gebruik gemaakt. Voor de introductie van gecloneerde genen in zoogdiercellen lijken virussen echter het meest geschikt. Het gaat hierbij vooral om kleine DNA-virussen (bijvoorbeeld SV40) en retrovirussen.

Gastheren

De meest gebruikte gastheren bij de moleculaire clonering zijn ongetwijfeld de mutanten van de E. coli-stam KI2. Voordelen van deze organismen zijn o.a. de snelle vermenigvuldiging in relatief eenvoudige kweeksystemen en de goede genetische karakterisering, waardoor het mogelijk is op basis van verschillende mutanten te werken met verschillende selectiesystemen.

Wanneer gewerkt wordt met een stam die deficiënt is voor één van de ongeveer 1000 genen die op het cirkelvormige chromosoom zijn gelegen, dan zal het DNA van de vector dit tekort moeten aanvullen. Het gebruik van gastheercellen is beperkt door richtlijnen uitgevaardigd door recombinant-DNA-commissies. Alleen die stammen die zo sterk gemuteerd zijn dat ze zich niet buiten het DNA-laboratorium kunnen handhaven, zijn toegestaan. Daarnaast zijn er fysische veiligheidseisen ten aanzien van een recombinant-DNA-laboratorium. Ook eukaryoten (gisten of schimmels) worden voor clonering gebruikt. Deze gastheren worden toegepast bij het tot expressie brengen van eukaryotische genen.

Enzymen

De moleculaire genetica zou niet zo'n spectaculaire ontwikkeling hebben doorgemaakt zonder de ontdekking van een groot aantal verschillende enzymen. Deze zijn nodig om grote DNA-moleculen in kleinere stukken te knippen en vervolgens de verkregen fragmenten te verbinden met DNA van een andere soort zodat recombinant-DNA wordt gevormd.1 Verder zijn er tientallen verschillende enzymen om in vitro iedere gewenste nucleotidenketen te kunnen maken of te merken met radioactiviteit of andere stoffen bruikbaar voor detectie.

Enzymen die in staat zijn nucleïnezuren af te breken, worden nucleasen genoemd.

– Exonucleasen zorgen voor een vertering van het DNA aan de uiteinden van de nucleotidenketen.

– Endonucleasen knippen daarentegen in de ketens. Dit kan zowel aspecifiek als specifiek gebeuren. Het laatste is het geval bij de restrictie-endonucleasen. Van deze enzymen, afkomstig uit bacteriën, zijn meerdere typen bekend. Bij het type dat het meest geschikt is voor de toepassing bij clonering en analyse van DNA wordt een door het enzym herkende specifieke nucleotidenvolgorde opengeknipt in beide strengen van de dubbele helix.

Er zijn nu ongeveer 500 verschillende bacteriële endonucleasen geïsoleerd.2 Ze hebben als functie vreemd DNA dat de bacterie kan binnendringen, open te knippen. Een ander enzymsysteem zorgt er voor dat het eigen bacterie-DNA beschermd wordt tegen de werking van het restrictie-enzym. Bij iedere herkenningsplaats worden één of twee nucleotiden gemethyleerd, zodat de restrictieplaats niet meer herkend wordt.

De naamgeving van restrictie-enzymen is een combinatie van de geslachtsnaam en de soortnaam van de betreffende bacterie; soms met een toevoeging om de gebruikte stam of extrachromosomale oorsprong aan te duiden. De minimale lengte van de nucleotidenvolgorde die herkend en geknipt kan worden, bedraagt vier nucleotiden. Een dergelijke tetranucleotidensequentie zal men gemiddeld iedere 44, is 1:256 base-paren (bp) vinden. Een enzym dat een hexanucleotide herkent, knipt daarentegen gemiddeld slechts eens per 4096 bp. De herkende nucleotiden-volgorden zijn meestal symmetrisch rond een as die loodrecht staat op de helix-as van het DNA (tabel).

Restrictie-endonucleasen van een bepaald type knippen op verschillende plaatsen in de twee strengen; er ontstaan fragmenten met korte stukken enkelstrengs DNA. Andere daarentegen knippen op exact dezelfde plaats in de twee strengen.

Behalve restrictie-enzymen worden nog veel andere enzymen gebruikt, o.a.:

– Polymerasen. Deze enzymen zorgen voor de assemblage van nucleotiden tot polynucleotiden. Een enzym dat veelvuldig wordt gebruikt, is het DNA-polymerase I. Het toont exonuclease-activiteit en is tevens in staat tot polymerisatie van deoxyribonucleotiden. Het wordt in combinatie met DNase I gebruikt voor in vitro-labeling van DNA door ‘nick’-translatie. Met deze methode kan een uniform gemerkt molecuul worden verkregen, doordat van een gezuiverd DNA-molecuul telkens een aantal nucleotiden wordt vervangen door radioactief of anderszins gemerkte nucleotiden.

– Reverse transcriptase. Ook dit is een polymerase, maar dan wel een heel bijzondere: een RNA-afhankelijke DNA-polymerase. Dit van retrovirussen (RNA-virussen) afkomstige enzym kan namelijk met een RNA-molecuul als matrijs de vorming van een DNA-molecuul katalyseren. Er ontstaat dan een zogenaamd complementair DNA (cDNA).

– Terminale transferase. Met dit enzym is het mogelijk aan een uiteinde van een DNA-streng nucleotiden toe te voegen zonder dat de aanwezigheid van een matrijs vereist is.

– DNA-ligase. Een enzym dat de vorming van fosfodiësterverbindingen katalyseert op de plaats van enkelstrengsbreuken in het DNA. Het kan worden gebruikt voor een efficiënte koppeling van DNA-fragmenten aan het vector-DNA wanneer beide typen DNA met hetzelfde restrictie-enzym zijn geknipt.

Probes

Met behulp van restrictie-enzymen kan het genoom in een groot aantal fragmenten verdeeld worden en vervolgens ingebouwd in een geschikte vector. Na de clonering in een gastheer ontstaat een bank of bibliotheek die het totale DNA van het onderzochte individu bevat.

Het herkennen van de kloon met het gen dat men wil onderzoeken lijkt welhaast onmogelijk vanwege het grote aantal. Men kan echter radioactief gemerkte complementaire moleculen (probes) gebruiken en door middel van autoradiografie nagaan waar hybridisatie optreedt. (Zie hiervoor het artikel in dit tijdschriftnummer over de methoden van de moleculaire genetica (1987; 2123-8).) Daarbij wordt een duplexmolecuul gevormd wanneer de basevolgorden in de twee strengen volmaakt complementair zijn. Het DNA- of RNA-molecuul dat gebruikt wordt om vast te stellen of het gewenste gen aanwezig is, wordt probe genoemd. Naast de vaak toegepaste methode een probe van een collega over te nemen (‘cloning by phoning’) zijn er verschillende mogelijkheden om de gewenste probe te maken.

Synthese en clonering van complementair DNA

Praktisch alle mRNA-moleculen die in een menselijke cel aanwezig zijn, bezitten een poly-A-staart. Na toevoeging van het complementaire poly-T kan zodoende een dubbelstrengs stukje AT ontstaan dat als startpunt kan dienen voor DNA-synthese met behulp van het enzym reverse transcriptase. Van het mRNA wordt op deze manier een exacte DNA-kopie gevormd (cDNA). Het DNA-molecuul kan dubbelstrengs gemaakt worden en na inbouw in een vector gecloneerd. Door middel van hybridisatie met mRNA worden de gecloneerde cDNA's herkend. Deze kunnen in vitro getranslateerd worden, zodat aan de hand van het geproduceerde eiwit kan worden nagegaan welk gen in een bepaalde vector is ingebouwd. Het gewenste DNA kan vervolgens in grote hoeveelheden worden opgekweekt.

Oligonucleotide probes

Zodra (een gedeelte van) de aminozuurvolgorde van een eiwit bekend is, kunnen van een stukje dat 5 tot 6 aminozuren omvat, alle mogelijke coderingen op RNA- en DNA-niveau worden voorspeld. Deze oligonucleotidensequenties worden synthetisch bereid en gebruikt voor het screenen van een DNA-bank. Tevens kan men er gebruik van maken bij de herkenning van specifiek mRNA en als ‘primer’ voor de synthese van cDNA met behulp van reverse transcriptase.

Bij de beschrijving van de basisbegrippen van de moleculaire genetica is het onmogelijk de stof van een aantal tekstboeken samen te vatten in enkele pagina's zonder veel weg te laten. Een nadere kennismaking met de methoden van de moleculaire genetica komt in het tweede artikel in dit tijdschriftnummer aan de orde.

Literatuur
  1. Nathans D, Smith HO. Restriction endonucleases in theanalysis and restructuring of DNA molecules. Ann Rev Biochem 1975; 44:273-93.

  2. Kessler C, Neumaier PS, Wolf W. Recognition sequencesrestriction endonucleases and methylases – a review. Gene 1985; 33:1-102.

Auteursinformatie

Rijksuniversiteit Limburg, Vakgroep GeneticaCelbiologie, Postbus 616, 6200 MD Maastricht.

Prof.dr.J.P.M.Geraedts, antropogeneticus.

Gerelateerde artikelen

Reacties