Therapeutisch kloneren: nog verre van toepasbaar

Zie ook het artikel op bl. 2109.

Nadat in het begin van de jaren tachtig van de vorige eeuw embryonale stamcellen waren geïsoleerd uit preïmplantatie-embryo's (blastocysten) bij de muis en in kweek waren gebracht,1 is gebleken dat deze cellen hun pluripotente eigenschappen behouden. Worden ze genetisch gemanipuleerd en geretransplanteerd in embryo's, dan kunnen ze weer aan de embryonale ontwikkeling deelnemen en dieren opleveren, waarvan het genoom veranderd is. In kweek kunnen embryonale stamcellen zich onder invloed van specifieke factoren tot een groot aantal celtypen differentiëren, zoals in epitheel-, zenuw-, hart- of skeletspiercellen.2

In 1998 zijn Thomson et al. erin geslaagd om ook humane embryonale stamcellen te maken uit embryo's, die bij in-vitrofertilisatie (IVF) waren overgebleven.3 Humane embryonale stamcellijnen zijn ook recentelijk door Australische onderzoekers ontwikkeld.4 Bij het ter perse gaan van dit artikel waren er reeds 64 embryonale-stamcellijnen geclaimd, inclusief die door biotechnologische bedrijven zijn gemaakt en die niet in de literatuur zijn beschreven.

Door het succesvol kloneren van vee, niet alleen uit celkernen van foetale, maar ook van volwassen weefsels5-7 is het nu mogelijk embryo's te maken uitgaande van de celkernen van volwassen mensen en uit deze embryo's weer stamcellen te isoleren.

therapeutisch kloneren

Door nu embryonale stamcellen zich na grootschalige kweek in een bepaalde richting te laten differentiëren, wordt het dus mogelijk nieuwe lichaamseigen cellen van de patiënt te maken, die bij hem- of haarzelf defect geraakt zijn. Hiermee zou een groot aantal ziekten kunnen worden behandeld, waarbij voorkomen wordt dat de cellen door immunologische afweerreacties worden afgestoten.8 9 Therapeutisch kloneren wordt daarom als een alternatief beschouwd voor transplantatie van genetisch gemodificeerde dierlijke organen naar de mens (xenotransplantatie), nu gebleken is dat hierbij endogene virussen worden overgedragen10 die de patiënt kunnen infecteren, met het nog grotere risico dat nieuwe virussen ontstaan.

Vorig jaar zijn in dit tijdschrift reeds twee artikelen verschenen over technische aspecten van kloneren bij de mens en de ethische problemen hierbij.11 12 Het eerste artikel geeft een overzicht van de mogelijkheden van reproductief kloneren door middel van kerntransplantaties bij onvruchtbaarheidsproblemen en bij een aantal genetische afwijkingen, alsmede van kloneren door splitsing van embryo's. Daarnaast komt ook therapeutisch kloneren beperkt ter sprake, waarbij reeds wordt aangegeven dat de therapie nog in de kinderschoenen staat en omgeven is met vele medisch-technische vragen, die nader onderzoek vergen.

In het huidige artikel ga ik dieper in op therapeutisch kloneren. In de figuur is een schema met betrekking tot therapeutisch kloneren weergegeven. Problemen die zich bij de afzonderlijke stappen voordoen, zijn de volgende.

Transplantatie van kernen van cellen van gedifferentieerde weefsels van volwassenen in onbevruchte eicellen

De efficiëntie van kloneren bij zoogdieren is bijzonder laag als cellen van volwassen dieren gebruikt worden voor het leveren van kernen. Als de geboorte van levensvatbare jongen als maat genomen wordt, is de efficiëntie niet meer dan 1-2. Dit houdt in dat honderden onbevruchte eicellen nodig zijn, waaruit eerst de eigen kern verwijderd moet worden, omdat embryo's die na IVF zijn overgebleven voor deze procedure minder geschikt zijn.13 De eicellen moeten worden geleverd door donoren in de vruchtbare leeftijd. Donatie van onbevruchte eicellen kan geschieden door een aantal bij IVF niet te laten bevruchten of, zoals in Amerika gebeurt, door ze tegen een grote vergoeding alleen voor donatie te gebruiken. Bij eicellen die worden ingevroren gaat, in tegenstelling tot bij spermacellen, de biologische kwaliteit verloren. Ook in-vitro-uitrijping onder invloed van hormonen verloopt bij vroege eicellen uit menselijke ovaria minder goed dan bij dierlijke eicellen.14 De embryo's die na bevruchting uit in vitro uitgerijpte eicellen ontstaan, vertonen vaak afwijkingen en defecten in de ontwikkeling.15

Bij de transplantatie van kernen uit volwassen weefsels in ontkernde onbevruchte eicellen (zogenaamd somatisch kloneren) en de daaropvolgende kunstmatige activatie komen in-vitro-embryo's tot ontwikkeling. Wanneer deze geïmplanteerd worden in de uterus van pseudo-zwangere dieren, blijkt slechts een deel hiervan nakomelingen te geven. Het niet tot volledige ontwikkeling komen van een deel van deze embryo's wordt veroorzaakt door genetische afwijkingen.16 In dat geval zijn deze embryo's, ook wanneer ze door kerntransplantatie verkregen zijn, ongeschikt voor het maken van goede embryonale stamcellen. Bij therapeutisch kloneren moeten de embryonale stamcellen een normaal diploïd aantal chromosomen (bij de mens 46) hebben, willen ze geschikt zijn voor transplantatie.

Voor het gebruik van kernen van cellen van gedifferentieerde weefsels bij kloneren is het van cruciaal belang, dat deze kernen geherprogrammeerd worden om weer pluripotentie te verkrijgen. Naarmate het weefsel ouder is en meer gedifferentieerd, verloopt deze herprogrammering moeilijker en wordt de efficiëntie van kloneren lager.17 Belangrijk in dit proces is de activatie van de genen die bij de vroege ontwikkeling een rol spelen en die het volwassen weefsel niet meer gebruikt. Daartoe moet een aantal eiwitten uit de kern verdwijnen en moeten eiwitten uit het cytoplasma van de eicel in de nieuwe kern migreren, waardoor het kern-DNA (chromatine) wordt geherstructureerd en methylgroepen van het DNA van een aantal inmiddels inactieve genen worden verwijderd.18 19 Deze herprogrammering mag niet te ver doorschieten en moet een aantal genen, die bij de spermatogenese geïnactiveerd worden en die dat na de bevruchting en ontwikkeling blijven, met rust laten. Bovendien heeft het DNA van gedifferentieerde weefsels tijdens het leven mutaties ondergaan en zijn de cellen hiervan onderhevig aan veroudering, zodat ze niet meer onbeperkt kunnen delen (tenzij het kankercellen worden). Deze intrinsieke veroudering is gekoppeld aan de afname van de lengte van de uiteinden van de chromosomen, de telomeren. Het is nog niet duidelijk of deze telomeren bij kloneren altijd kunnen regenereren.20 21 Dus de verjonging door herprogrammering van de getransplanteerde kernen kan wel eens verre van optimaal zijn. Het feit dat veel gekloneerde dieren niet levensvatbaar zijn, geeft dan ook te denken.

De embryonale ontwikkeling van de eicel en het in kweek brengen van embryonale stamcellen

De eicellen, die voorzien zijn van een nieuwe kern, kunnen kunstmatig worden geactiveerd en in kweek uitgroeien tot het blastocystenstadium, dat voorafgaat aan de implantatie in de baarmoederwand. Uit de binnenste celmassa van de blastocyste worden de embryonale stamcellijnen gemaakt, die zich in kweek onbeperkt kunnen delen. Het maken van nieuwe embryonale stamcellijnen is echter verre van simpel. Het vereist speciale kweektechnieken en ervaring. De combinatie van de lage efficiëntie bij kloneren en het feit dat slechts een beperkt deel van de preïmplantatie-embryo's permanente stamcellijnen geeft, maakt het verkrijgen van nieuwe embryonale stamcellen voor therapeutisch kloneren erg tijdrovend.

De differentiatie van embryonale stamcellen tot bepaalde celtypen die de patiënt nodig heeft

Celdifferentiatie in kweek is vaak niet volledig, doordat de afzonderlijke cellen niet in dezelfde mate reageren op een bepaalde concentratie van een inducerende stof en dit bovendien op verschillende tijdstippen na toediening doen. Sommige cellen differentiëren zich volledig, terwijl andere dat later doen of helemaal niet. De volledige differentiatie is echter een absolute voorwaarde wil transplantatie zonder risico's zijn, omdat de ongedifferentieerde humane embryonale stamcellen zich tot goedaardige kiemceltumoren (teratomen) kunnen ontwikkelen.3 Wil een selectie van gedifferentieerde cellen volledig zijn, dan moeten embryonale stamcellen genetisch gemanipuleerd worden. Hierbij wordt een gen ingebracht, dat resistentie geeft tegen een letaal antibioticum en alleen tot expressie komt onder invloed van een weefselspecifieke promotor, die slechts geactiveerd wordt in cellen die zich in de vereiste richting differentiëren. De cellen die dat niet doen en daardoor niet geschikt zijn voor transplantatie, gaan dood wanneer ze aan een bepaalde concentratie van het antibioticum worden blootgesteld. Op die manier is het gelukt zuivere populaties van hartspiercellen22 en zenuwcellen23 te krijgen.

De retransplantatie van gedifferentieerde cellen in defecte organen van de patiënt

Een groot probleem is om de cellen op de juiste plek te krijgen bij de acceptor, migratie die vaak wordt aangeduid met de Engelse term ‘homing’. Voor bloedvormende cellen is dit nog het gemakkelijkst, aangezien ze in de bloedbaan ingespoten kunnen worden en zich vervolgens in het beenmerg nestelen. Ook de lever kan tijdelijk aggregaten van pancreaseilandjescellen invangen, zoals na in-vivoperfusie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans via de V. portae. Voor zenuwweefsel is de homing al een stuk moeilijker. Zenuwcellen moeten functionele verbindingen kunnen maken met het bestaande zenuwweefsel. Voor het herstel van bekledend (epitheel)weefsel van inwendige organen is de opgave van een goede homing bijna een onmogelijke. Om de cellen ter plekke te krijgen moeten ze in feite over invasieve groei-eigenschappen beschikken, die bij kwaadaardige tumorcellen voorkomen. Verder moeten ze ter plekke de adhesiemoleculen tot expressie brengen, met behulp waarvan epitheelcellen zich hechten.

Kortom, de complexe organisatie van weefsels en organen, die tijdens de foetale ontwikkeling tot stand gekomen is en die in hoge mate is afgestemd op het optimaal laten functioneren van deze organen, maakt gerichte celtherapie moeilijk. Al te gemakkelijk wordt verondersteld dat nieuwe behandelingen voor ziekten als diabetes in de toekomst mogelijk zijn. Een blik door de microscoop op een weefselcoupe van de alvleesklier laat zien, dat niets moeilijker is dan losse nieuwe insulineproducerende ?-cellen in de eilandjes van Langerhans te krijgen, waarbij bovendien de kans bestaat dat deze wederom door een auto-immuunreactie van de diabeticus worden afgebroken. Celtherapie wordt alleen zinvol als driedimensionale kweektechnieken worden ontwikkeld waarbij de structuur van de weefsels beter benaderd wordt dan in de gebruikelijke tweedimensionale kweek van cellen op platte bodems.24

alternatieven

Misschien is het daarom verstandiger bestaande humane embryonale stamcellijnen te gebruiken, al kleeft hieraan ook een aantal van de reeds genoemde bezwaren. Door in de embryonale stamcellen de genen die verantwoordelijk zijn voor de afstoting uit te schakelen en ook selectiegenen in te bouwen (die genen zorgen voor een volledige weefselspecifieke differentiatie), is het wellicht mogelijk om een zuivere populatie cellen van hetzelfde type te krijgen. Op die manier kunnen universele (voor alle mensen toepasbare) donorcellijnen worden ontwikkeld. Een andere mogelijkheid is een bank van verschillende embryonale stamcellijnen op te zetten en de cellen na differentiatie te typeren, zoals bij orgaantransplantatie gebeurt. Ook is het niet ondenkbaar, dat het in de verre toekomst mogelijk wordt om kernen van gedifferentieerde cellen van een patiënt kunstmatig (dat wil zeggen buiten donoreicellen om) te herprogrammeren en in ontkernde bestaande embryonale stamcellen te transplanteren, zodat isogene stamcellen zonder kloneren kunnen worden verkregen.

Verder zijn andere mogelijkheden voor het verkrijgen van specifieke cellen uit adulte stamcellen nog lang niet uitgeput. Zo kunnen uit foetale hersenen neurale stamcellen worden geïsoleerd, die zich tot verschillende typen zenuwcellen differentiëren.25 De differentiatie van weefselspecifieke (Engels: ‘committed’) stamcellen blijkt verder minder specifiek dan altijd werd verondersteld. Zo kunnen de neurale stamcellen in een andere omgeving bloedcellen vormen.26 Evenzo blijken hemopoëtische stamcellen bij te kunnen dragen aan de vorming van spier-,27 hersen-28 en levercellen.29 Recentelijk hebben onderzoekers aangetoond dat, wanneer stamcellen uit het beenmerg in de geïnfarceerde hartspier van een muis worden ingespoten, deze cellen nieuwe hartspiercellen kunnen vormen en bij kunnen dragen aan een gedeeltelijke genezing.30 Daarom is de aanleg van een bank van stamcellen uit het navelstrengbloed (zoals de firma Cryo-Cell doet) belangrijk voor de toekomstige beschikbaarheid van isogene stamcellen.

conclusie

Het concept van therapeutisch kloneren spreekt tot de verbeelding, maar gezien de vele praktische problemen die daarbij komen kijken is het vooralsnog een onhaalbare kaart en is het veel te voorbarig om hoop op genezing bij patiënten te wekken.