Ras-oncogendetectie in faeces van patiënten met colorectumtumoren

Onderzoek
J.J. Koornstra
A. Ulvik
O. Røkke
J.F. Halvorsen
K. Haug
D. Øgreid
Citeer dit artikel als
Ned Tijdschr Geneeskd. 1995;139:2732-6
Abstract
Download PDF

Samenvatting

Doel

Onderzoeken van de mogelijkheid om in faeces van patiënten met colorectale tumoren gemuteerde K-ras-oncogenen aan te tonen, met behulp van de polymerase-kettingreactie (PCR).

Plaats

Haukeland Universiteitsziekenhuis, Bergen, Noorwegen.

Methoden

Van 25 patiënten die werden verwezen naar de chirurgische afdeling voor coloscopie of chirurgie werd faecesmateriaal verzameld. Van de vervolgens aangetroffen colorectale tumoren werden biopten genomen, die met PCR-‘single-stranded-conformation-polymorphism’ werden geanalyseerd op de aanwezigheid van puntmutaties in het K-ras-oncogen. Daarna werd met ‘allel-specifieke amplificatie’ onderzocht of dezelfde mutatie in de overeenkomstige faecesmonsters aantoonbaar was.

Resultaten

Bij de helft (1327) van de tumorbiopten werden puntmutaties in het K-ras-oncogen aangetoond. Het betrof zowel carcinomen als adenomen. In 60 van de bijbehorende faecesmonsters werd vervolgens dezelfde mutatie gedetecteerd.

Conclusie

Met PCR-technieken is het mogelijk om K-ras-mutaties aan te tonen in faeces van patiënten met colorectale tumoren met die mutaties.

Inleiding

Zie ook het artikel op bl. 2714.

Inleiding

Het colorectumcarcinoom behoort tot de meest voorkomende maligniteiten in de westerse wereld.1 De prognose wordt voornamelijk bepaald door de mate van uitbreiding op het moment dat de diagnose gesteld wordt.2 Bij een aanzienlijk deel van de patiënten wordt de tumor pas ontdekt als transmurale uitbreiding reeds heeft plaatsgevonden en de kans dat chirurgie curatief is gering is.3 Een effectieve vorm van vroege diagnostiek zou het sterftecijfer van colorectumcarcinoom drastisch kunnen verminderen. Op dit moment is de enige non-invasieve screeningstest de detectie van occult bloed in faeces. Mede door de lage specificiteit, met als gevolg een groot aantal fout-positieve uitslagen, wordt deze test als insufficiënt beschouwd, maar alternatieven zijn momenteel niet voorhanden.145

Nieuwe concepten voor vroege diagnostiek en screening zijn voortgekomen uit de snel toegenomen kennis van moleculair-genetische achtergronden van colorectale carcinogenese. In dit tijdschrift is gewezen op de belangrijkste ontwikkelingen in dit verband.6 Allereerst is duidelijk geworden dat colorectumcarcinomen zich geleidelijk ontwikkelen vanuit goed gedefinieerde voorstadia. Dit tumorprogressiemodel staat bekend als adenoma-carcinoma-sequentie.7 Daarnaast blijkt een variabele reeks van moleculair-genetische veranderingen op te treden tijdens de ontwikkeling van colorectumcarcinoom. Het betreft zowel activatie van oncogenen als inactivatie van tumorsuppressiegenen.89 Er blijkt een nauwe samenhang te bestaan tussen de accumulatie van genetische veranderingen in coloncellen en de adenoma-carcinoma-sequentie.1011

Deze nieuwe inzichten bieden aangrijpingspunten voor praktische toepassingen. Bekend is dat colonepitheelcellen voortdurend delen, waarbij afgestoten cellen in het darmlumen terechtkomen en zich met faeces vermengen. Cellen afkomstig van colorectale adenomen of carcinomen zouden derhalve theoretisch in faeces detecteerbaar moeten zijn. Dit werd voor het eerst in de praktijk gerealiseerd in 1992 door Sidransky et al.12

Wij onderzochten de mogelijkheid om cellen die afkomstig zijn van colorectale tumoren, in fecaal materiaal aan te tonen met gebruik van de polymerase-kettingreactie (PCR).13 Met deze methode bleek het eerder mogelijk om minimale hoeveelheden bacterieel DNA in faeces op te sporen.14

Als moleculair-genetische ‘marker’ van colorectale tumorcellen kozen wij gemuteerde ras-oncogenen. Deze genen coderen voor eiwitprodukten die een rol spelen in celproliferatie en -differentiatie. Mutaties in ras-genen leiden tot oncogene activering, hetgeen betekent dat door de veranderde eiwitprodukten voortdurend groeistimulerende signalen uitgezonden worden.15 In de colorectale carcinogenese worden relatief vroeg genetische veranderingen in ras-genen gevonden, meestal in de vorm van puntmutaties. Deze mutaties komen voor bij circa 50 van colorectale adenomen groter dan 1 cm en bij carcinomen. Het betreft voornamelijk mutaties in codon 12 en 13 van het K-ras-gen.16-19

PatiËnten en methoden

Aan het onderzoek namen 25 patiënten deel: 10 mannen en 15 vrouwen. De leeftijd varieerde van 49 tot 90 jaar en bedroeg gemiddeld 70 jaar. Bij 10 patiënten die in verband met colorectumcarcinoom electieve colorectale chirurgie ondergingen, werd een faecesmonster verkregen voordat preoperatieve lavage werd uitgevoerd. Bij 15 patiënten bij wie met behulp van coloscopie een colorectale tumor werd vastgesteld, werd circa 20 ml spoelvloeistof opgevangen voordat biopsie werd verricht. Alle faecesmonsters werden opgeslagen bij -80°C.

Van de coloscopisch vastgestelde colorectale tumoren werden biopten genomen. Van de chirurgisch verkregen preparaten werd representatief tumorweefsel genomen. Bij 1 patiënt werden peroperatief 2 adenomen gevonden, bij een andere patiënt 2 gelijktijdig voorkomende carcinomen. In totaal werden 27 weefselfragmenten verzameld. De preparaten werden door één patholoog-anatoom beoordeeld.

Moleculair-biologische detectiemethoden

DNA werd uit de tumorbiopten geëxtraheerd volgens standaardtechnieken.20 Vervolgens werd met PCR een fragment van het K-ras-gen van 221 basenparen geampiificeerd. De aanwezigheid van mutaties in codon 12 en 13 van het geamplificeerde DNA-fragment werd bepaald met ‘single-stranded conformation polymorphism’ (SSCP)-analyse. Bij deze methode worden puntmutaties in een vermenigvuldigd DNA-fragment aangetoond aan de hand van de conformationele veranderingen van dit stukje DNA.21-23 De conformatie is namelijk afhankelijk van de basenvolgorde van het DNA-fragment en bepaalt mede de loopsnelheid van het DNA bij elektroforese in een polyacrylamide-gel. Verschillen in slechts één base kunnen resulteren in verschillende elektroforetische loopsnelheid (mobiliteit) van de DNA-fragmenten.23 Na gel-elektroforese kunnen de DNA-fragmenten door zilverkleuring zichtbaar worden gemaakt met behulp van het Pharmacia Phast System (Pharmacia LKB Technology, Uppsala, Zweden; figuur 1).

Na PCR-SSCP-analyse van het tumor-DNA werd onderzocht of in de faecesmonsters dezelfde mutatie aantoonbaar was met behulp van zogenaamde allelspecifieke amplificatie (ASA).24 Met deze techniek, een modificatie van de PCR, kunnen bekende mutaties in DNA worden aangetoond. De methode is gebaseerd op de waarneming dat DNA niet geamplificeerd wordt als een primer (het complementaire stukje DNA vanwaaruit de DNA-amplificatie plaatsvindt) een zogenaamde ‘mismatch’ (een niet-complementaire D 1.A-sequentie) bevat aan het 3‘-uiteinde (dat is het uiteinde vanwaaruit, na de binding van de primer aan de DNA-streng, de amplificatie start). Met ASA kunnen derhalve puntmutaties worden vastgesteld door primers te ontwerpen die wel compleet ’matchen‘ met een sequentie met een bekende mutatie. Onder bepaalde voorwaarden zal dan de gemuteerde sequentie selectief geamplificeerd worden boven de normale sequentie. De sensitiviteit van deze methode is dusdanig dat één gemuteerde cel kan worden gedetecteerd in een mengsel met 1000 normale cellen.25

Bewerking van de monsters

Om humaan DNA uit faeces te isoleren werd 10 mg faeces dan wel colorectale spoelvloeistof opgelost in een lyserende buffer. Na homogenisering werd het monster gecentrifugeerd om zoveel mogelijk bacterieel DNA en andere verontreiniging te verwijderen. Humaan DNA werd vervolgens uit het supernatans geëxtraheerd met behulp van de ‘Qiagen cell culture DNA kit’ (Qiagen Inc, Chatsworth, Calif., USA). Ten slotte werd het DNA opgelost in een zoutbuffer.

Voor ASA werden verschillende primers ontworpen naar aanleiding van de gevonden mutaties in de tumoren. Het DNA uit de faeces werd onderworpen aan 50 tot 60 PCR-cycli. Amplificatieprodukten ondergingen elektroforese in een 3-agarose-gel en werden zichtbaar gemaakt met behulp van ethidiumbromide. DNA van de overeenkomstige tumoren vormde de positieve controles. De negatieve controles werden gevormd door faeces van gezonde vrijwilligers, van patiënten met colorectale tumoren zonder mutaties in K-ras, en van patiënten met een andere mutatie in K-ras.

Resultaten

Bij 13 van de 27 geanalyseerde colorectale weefselfragmenten werd een puntmutatie in codon 12 of 13 van het K-ras-oncogen gevonden. Het betrof 9 carcinomen en 4 adenomen. Dit laatste bevestigde de potentiële rol van K-ras-mutaties als een relatief vroege indicator van colorectale neoplasie. Er werden 6 verschillende mutaties gevonden, waarvan 5 in codon 12 en 1 in codon 13. De meest frequente mutatie werd gevonden in codon 12, waarbij de tweede G (guanine) in een A (adenine) veranderd was, leidend tot substitutie van het aminozuur glycine door asparaginezuur. Van een van de adenomen werd een ongewoon SSCP-patroon verkregen, hetgeen na directe sequentiëring (dat is de bepaling van de exacte basenvolgorde) van het DNA-fragment bleek te berusten op een dubbelmutatie van GGT naar TTT.

Bij 12 patiënten werd een K-ras-mutatie in de tumor vastgesteld (tabel). Bij 3 van hen werd het faecesmonster tijdens coloscopie verkregen en bij alle 3 was de mutatie in de colorectale spoelvloeistof aantoonbaar. Bij de andere 9 werd een faecesmonster verkregen voor preoperatieve lavage. Bij 5 was de mutatie in het faecesmonster aantoonbaar. In totaal kon derhalve in 8 faecesmonsters een K-ras-mutatie worden aangetoond, steeds dezelfde mutatie als in de bijbehorende tumor (figuur 2). Ook bij een van de rechtszijdig gelokaliseerde tumoren werd de mutatie in faeces gevonden. Fout-positieve uitslagen werden niet verkregen.

Beschouwing

Ondanks het kleine aantal patiënten van dit onderzoek tonen onze resultaten aan dat het mogelijk is om K-ras-oncogenmutaties in faeces van patiënten met colorectale tumoren die dat soort mutaties hebben, aan te tonen met behulp van PCR-technieken. De specificiteit van detectie van K-ras-mutaties in faeces lijkt zeer hoog. Hoewel ook bij patiënten met pancreascarcinoom ras-mutaties in faeces zijn aangetoond,27 zijn bij gezonde personen tot nu toe geen K-ras-mutaties gevonden.1617 Wel troffen wij K-ras-mutaties aan bij 4 adenomen, hetgeen de potentiële rol van K-ras-mutaties als een vroege indicator van colorectale neoplasie bevestigt.

Een beperking van ras-detectie in faeces voor screening op colorectale neoplasie is dat slechts bij de helft van alle colorectale tumoren een mutatie in K-ras optreedt.

Het detectiepercentage van mutaties in de faecesmonsters van onze patiënten was circa 60. In 5 gevallen werd geen mutatie in de faeces gedetecteerd. Een tweetal factoren zou hierbij een rol kunnen spelen. Ten eerste was er mogelijk een te gering aantal gemuteerde colonepitheelcellen ten opzichte van het aantal normale cellen in de faecesmonsters. Ten tweede lijkt de amplificatie van humaan DNA uit faeces bemoeilijkt te worden door de aanwezigheid van bepaalde PCR-inhiberende factoren.1228 De invloed van deze remmende factoren lijkt slechts gedeeltelijk gereduceerd te kunnen worden door de gebruikte DNA-isolatiemethode (met behulp van het Qiagen-reagentium).

Zeer onlangs rapporteerden Smith-Ravin et al. vergelijkbare resultaten, met een detectiepercentage van 50.29 Indien de detectie van K-ras-mutaties uitgebreid zou kunnen worden met gelijktijdige detectie in faeces van andere gemuteerde genen die een rol spelen tijdens de colorectale carcinogenese (zoals p53-gen of APC-gen), zou in theorie een groot aantal colorectale tumoren non-invasief opgespoord kunnen worden. Vervolgonderzoek in deze richting zal zeker de moeite waard zijn.

Conclusie

Onze onderzoeksresultaten bevestigen eerdere waarnemingen dat het mogelijk is gemuteerde K-ras-oncogenen op te sporen in faeces van patiënten met colorectale tumoren waarin die mutaties voorkomen. De waarde van de opsporing van moleculaire veranderingen in faeces in de vroege diagnostiek van colorectale tumoren zal in de komende jaren nader bepaald moeten worden.

Wij danken prof.dr.A.Myking, patholoog-anatoom, Haukeland Ziekenhuis, Bergen, voor de beoordeling van de weefselpreparaten, prof.dr.B.de Jong, tumorcytogeneticus, en dr.H.Scheffer, klinisch moleculair geneticus, van de vakgroep Medische Genetica, Rijksuniversiteit Groningen, en mw.A.C.Kole, arts-onderzoeker, afdeling Chirurgische Oncologie van het Academisch Ziekenhuis Groningen, voor commentaar op eerdere versies van dit manuscript.

Dit onderzoek werd mede gefinancierd door de Jan Kornelis de Cockstichting (Groningen), de Norwegian Cancer Association (Oslo) en het Rebecca Ege Hegermanns Legat (Bergen).

Literatuur
  1. Cohen AM, Minsky BD, Schilsky RL. Colon cancer. In: DeVitaVT jr, Hellman S, Rosenberg SA, editors. Cancer: principles and practice ofoncology. Philadelphia: Lippincott, 1993:929-77.

  2. Järvinen HJ, Ovaska J, Mecklin JP. Improvements inthe treatment and prognosis of colorectal carcinoma. Br J Surg1988;75:25-7.

  3. Dunlop MG. Screening for large bowel neoplasms inindividuals with a family history of colorectal cancer. Br J Surg1992;79:488-94.

  4. St. John DJB, Young GP, Alexeyeff MA, Deacon MC,Cuthbertson AM, Macrae FA, et al. Evaluation of new occult blood tests fordetection of colorectal neoplasia. Gastroenterology1993;104:1661-8.

  5. Ahlquist DA, Wieand HS, Moertel CG, McGill DB, LoprinziCL, O'Connell MJ, et al. Accuracy of fecal occult blood screening forcolorectal neoplasia. A prospective study using Hemoccult and HemoQuanttests. JAMA 1993;269:1262-7.

  6. Offerhaus GJA, Baas IO. Moleculair-genetischeaanknopingspunten voor preventie en behandeling van colorectumcarcinomen.Ned Tijdschr Geneeskd1994;138:561-4.

  7. Muto T, Bussey HJR, Morson BC. The evolution of cancer ofthe colon and rectum. Cancer 1975;36:2251-70.

  8. Weinberg RA. Oncogenes, antioncogenes, and the molecularbases of multistep carcinogenesis. Cancer Res 1989;49:3713-21.

  9. Kerr IB. Molecular genetics of colorectal carcinoma. BMJ1989;299: 637-8.

  10. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectaltumorigenesis. Cell 1990;61:759-67.

  11. Bootsma AH, Cornelisse CJ, Klein A de. Oncogenen,tumorsuppressiegenen en de medische genetica van kanker.Ned Tijdschr Geneeskd1992;136:1009-13.

  12. Sidransky D, Tokino T, Hamilton SR, Kinzler KW, Levin B,Frost P, et al. Identification of ras oncogene mutations in the stool ofpatients with curable colorectal tumors. Science 1992;256:102-5.

  13. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R,Horn GT, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with athermostable DNA polymerase. Science 1988;239:487-91.

  14. Gumerlock PH, Tang YJ, Meyers FJ, Silva J jr. Use of thepolymerase chain reaction for the specific and direct detection ofClostridium difficile in human feces. Rev Infect Dis1991:13:1053-60.

  15. Barbacid M. Ras genes. Annu Rev Biochem1987;56:779-827.

  16. Bos JL, Fearon ER, Hamilton SR, Verlaan-de Vries M, BoomJH van, Eb AJ van der, et al. Prevalence of ras gene mutations in humancolorectal cancers. Nature 1987;327:293-7.

  17. Forrester K, Almoguera C, Han K, Grizzle WE, Perucho M.Detection of high incidence of K-ras oncogenes during human colontumorigenesis. Nature 1987;327:298-303.

  18. Burmer CC, Rabinovitch PS, Loeb LA. Analysis of c-Ki-rasmutations in human colon carcinoma by cell sorting, polymerase chainreaction, and DNA sequencing. Cancer Res 1989;49:2141-6.

  19. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, PreisingerAC, Leppert M, et al. Genetic alterations during colorectal-tumordevelopment. N Engl J Med 1988;319:525-32.

  20. Davis LG, Battey J, Dibner MD. Basic methods in molecularbiology. New York: Elsevier, 1986.

  21. Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, Hayashi K. Rapid andsensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using thepolymerase chain reaction. Genomics 1989;5:874-9.

  22. Suzuki Y, Orita M, Shiraishi M, Hayashi K, Sekiya T.Detection of ras gene mutations in human lung cancers by single-strandconformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products.Oncogene 1990;5:1037-43.

  23. Korn SH, Moerkerk PTM, Goeij AFPM de. Niet-radioactievedetectie van puntmutaties in het K-ras gen met behulp van single strandedconformation polymorphism (SSCP) analyse. Tijdschr NVKC 1993;18:73-7.

  24. Sommer SS, Groszbach AR, Bottema CDK. PCR amplificationof specific alleles (PASA) is a general method for rapidly detecting knownsingle-base changes. Biotechniques 1992;12:82-7.

  25. Stork P, Loda M, Bosari S, Wiley B, Poppenhusen K, WolfeH. Detection of K-ras mutations in pancreatic and hepatic neoplasms bynon-isotopic mismatched polymerase chain reaction. Oncogene1991;6:857-62.

  26. Dukes CE. The classification of cancer of the rectum. JPathol Bacteriol 1932;35:323-32.

  27. Caldas C, Hahn SA, Hruban RH, Redston MS, Yeo CJ, KernSE. Detection of K-ras mutations in the stool of patients with pancreaticadenocarcinoma and pancreatic ductal hyperplasia. Cancer Res1994;54:3568-73.

  28. Wilde J, Eiden J, Yolken R. Removal of inhibitorysubstances from human fecal specimens for detection of group A rotaviruses byreverse transcriptase and polymerase chain reactions. J Clin Microbiol1990;28:1300-7.

  29. Smith-Ravin J, England J, Talbot IC, Bodmer W. Detectionof c-Kiras mutations in faecal samples from sporadic colorectal cancerpatients. Gut 1995;36:81-6.

Auteursinformatie

Haukeland Universiteitsziekenhuis, Centrum voor Moleculaire Geneeskunde, Bergen, Noorwegen.

J.J.Koornstra, co-assistent (thans: assistent-geneeskundige, Medisch Spectrum Twente, afd. Interne Geneeskunde, Postbus 50.000, 7500 KA Enschede); A.Ulvik, moleculair bioloog; O.Røkke en J.F.Halvorsen, chirurgen; K.Haug, epidemioloog; dr.D.Øgreid, celbioloog.

Contact J.J.Koornstra

Gerelateerde artikelen

Reacties

D.W.
Swinkels

Nijmegen, januari 1996,

Met belangstelling lazen wij het artikel van Koornstra et al. (1995;2732-6). Wij zijn het met de auteurs eens dat met de mogelijkheid van detectie van K-ras-mutaties in DNA geïsoleerd uit feces goede perspectieven worden geboden voor moleculaire vroege diagnostiek van colorectale tumoren. Toch willen wij een drietal opmerkingen plaatsen.

De auteurs gebruiken allel-specifieke amplificatie (ASA) om K-ras-mutaties in feces aan te tonen. Primers werden gekozen aan de hand van de gevonden mutaties in de tumor. Dit impliceert dat alleen dezelfde mutaties als die in de tumor gevonden worden en dat mutaties die niet overeenstemmen met deze tumormutaties worden gemist. De gebruikte ASA-methode is slechts geschikt voor de detectie van alle K-ras-mutaties als het totale aantal gebruikte primers correspondeert met het aantal mogelijke mutaties; in het geval van codon 12 en 13 van het K-ras-gen zijn dit er in totaal 12 (4 sets van 3).12 Voorts hebben anderen laten zien dat de ASA-methode ook fout-positieve uitslagen kan opleveren.3 Ook moet gezegd worden dat ASA alleen gebruikt kan worden voor de detectie van bekende, gelokaliseerde puntmutaties; ze is ongeschikt voor de detectie van andere, ook bij de colorectale carcinogenese betrokken, gemuteerde genen met puntmutaties en deleties over een groot gebied in het gen, zoals het P53- en het APC-gen.

Een tweede opmerking betreft de 5 patiënten uit de groep van 13 met een bewezen K-ras-mutatie in het tumorweefsel bij wie de mutatie niet in feces werd gedetecteerd. Onduidelijk blijft of hier wel DNA uit feces kon worden geïsoleerd of dat er sprake was van polymerase-kettingreactie-inhiberende factoren in het DNA-isolaat of dat de hoeveelheid DNA in feces afkomstig uit de tumorcellen beneden de detectiegrens lag.

Ten slotte schrijven de auteurs dat 8 van de 13 fecesmonsters van patiënten met een K-ras-mutatie positief worden bevonden. Hierbij geven zij aan dat het in één geval een rechtszijdige tumor betrof, daarmee suggererend dat detectie ook bij proximale tumoren van het maag-darmkanaal mogelijk zou zijn. Behalve de lokalisatie is echter ook de grootte van de tumor van belang, vooral bij de vroege diagnostiek.1 Deze wordt voor de bestudeerde tumoren niet aangegeven.

Het gebruik van puntmutaties als tumormerker in de vroege diagnostiek van carcinomen lijkt een realistisch toekomstbeeld. Het is evenwel essentieel dat daarbij de juiste methoden worden gebruikt.

D.W. Swinkels
J. de Kok
G.N.P. van Muijen
J.L. Willems
Literatuur
  1. Hasegawa Y, Takeda S, Ichii S, Koizumi K, Maruyama M, Fujii A, et al. Detection of K-ras mutations in DNAs isolated from feces of patients with colorectal tumors by mutant-allele-specific amplification (MASA). Oncogene 1995;10:1441-5.

  2. Delattre O, Olschwang O, Law DJ, Melot T, Remvikos Y, Salmon RJ, et al. Multiple genetic alterations in distal and proximal colorectal cancer. Lancet 1989;ii:353-6.

  3. Kwok S, Kellogg DE, McKinney N, Spasic D, Goda L, Levenson C, et al. Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies. Nucl Acids Res 1990;18:999-1005.

J.J.
Koornstra

Enschede, Bergen (Noorwegen), februari 1996,

Wij danken collega Swinkels et al. voor hun reactie op ons artikel. Ten aanzien van het gebruik van allel-specifieke amplificatie (ASA) om K-ras-mutaties in feces aan te tonen schetsen zij terecht een aantal beperkingen van deze techniek. De voornaamste is dat alleen bekende gelokaliseerde puntmutaties gedetecteerd kunnen worden.1 Voorts is het inderdaad zo dat indien men met ASA alle mogelijke mutaties in codon 12 en 13 van K-ras zou willen opsporen, 12 verschillende polymerasekettingreactie (PCR)-onderzoeken met steeds andere primers noodzakelijk zijn. Deze beperking zou theoretisch gedeeltelijk te ondervangen zijn door bij PCR gelijktijdig meer primers te gebruiken. Eerdere experimenten in ons laboratorium met een dergelijke ‘multi-PCR’-opzet waren niet buitengemeen succesvol. Wij zijn het met Swinkels et al. eens dat ASA zeker niet de ideale techniek is om onbekende gemuteerde genen in feces op te sporen. Desondanks is bij alle onlangs gepubliceerde onderzoeken op dit gebied toch ook deze techniek gebruikt.23

Van de 5 patiënten met een bewezen K-ras-mutatie in het tumorweefsel, bij wie de mutatie niet in de feces kon worden gedetecteerd, is ook ons onduidelijk welke factoren hierbij een rol spelen. Bij hen werd wèl DNA uit feces geïsoleerd, maar na ASA kon geen amplificatieproduct worden aangetoond.

Met betrekking tot de grootte van de bestudeerde tumoren zij opgemerkt dat alleen tumoren groter dan 1 cm werden geanalyseerd aangezien de frequentie van K-ras-mutaties in adenomen kleiner dan 1 cm namelijk minder is dan 10%.4 Dit geldt zowel voor adenomen bij adenomateuze polyposis coli als voor ‘sporadische’ adenomen.5 Inmiddels hebben wij onderzoek verricht naar de opsporing van K-ras-mutaties in feces, met een alternatieve techniek zonder de beperkingen van ASA. Zonder vooraf op de hoogte te zijn van de aan- of afwezigheid van een mutatie in de tumor, werden feces van patiënten met (reeds vastgestelde) colorectale tumoren geanalyseerd. De mutaties die met deze methode in de feces werden gevonden, bleken in alle gevallen ook in de overeenkomstige tumoren aantoonbaar. Ten aanzien van eventuele toepassing van deze methode in de moleculair-genetische vroege diagnostiek van colorectale tumoren zijn wij dan ook voorzichtig optimistisch gestemd.

J.J. Koornstra
D. Greid
Literatuur
  1. Bottema CDK, Sommer SS. PCR amplification of specific alleles: rapid detection of known mutations and polymorphisms. Mutat Res 1993;288:93-102.

  2. Smith-Ravin J, England J, Talbot IC, Bodmer W. Detection of c-Ki-ras mutations in faecal samples from sporadic colorectal cancer patients. Gut 1995;36:81-6.

  3. Hasegawa Y, Takeda S, Ichii S, Koizumi K, Maruyama M, Fujii, et al. Detection of K-ras mutations in DNAs isolated from feces of patients with colorectal tumors by mutant-allele-specific amplification (MASA). Oncogene 1995;10:1441-5.

  4. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert M, et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med 1988;319:525-32.

  5. Farr CJ, Marshall CJ, Easty DJ, Wright NA, Powell SC, Paraskeva C. A study of ras gene mutations in colonic adenomas from familial polyposis coli patients. Oncogene 1988;3:673-8.