Onderscheid tussen renale en niet-renale hematurie met immunoperoxydasekleuring van erytrocyten in urine op Tamm-Horsfall-eiwit
Open

Onderzoek
18-08-1992
P.M.W. Janssens, L.A.H. Monnens en J.L. Willems

Een beschreven methode om renale en niet-renale hematurie van elkaar te onderscheiden door middel van immunocytochemische kleuring van erytrocyten in de urine werd zodanig aangepast dat ze toepasbaar is in ziekenhuislaboratoria. De methode gaat uit van de waarneming dat alleen bij renale hematurieën de erytrocyten in de urine gecoat zijn met het uit niertubuli afkomstige Tamm-Horsfall-eiwit. Coating van erytrocyten met Tamm-Horsfall-eiwit kon goed zichtbaar gemaakt worden met een versterkte indirecte immunoperoxydasekleuring, waarbij gekleurde cellen onder de lichtmicroscoop donkerbruine randen vertoonden. De kleuring werd toegepast op urinemonsters van patiënten met hematurie van wie bekend was of deze van renale of niet-renale oorsprong was. Deze resultaten werden vergeleken met de score van het relatieve aantal dysmorfe erytrocyten, eveneens een middel om renale van niet-renale hematurie te onderscheiden. Bij zuiver renale hematurieën werd zonder uitzondering een relatief groot aantal immunochemisch gekleurde erytrocyten gevonden, gemiddeld 86 (SD 8,7; n = 26). Bij niet-renale hematurieën kleurden weinig erytrocyten, 13 (SD 13,5; n = 21). Ook bij bloedingen in het nierbekken kleurden weinig cellen (6; SD 5,8; n = 4). De immunocytochemische test is gekenmerkt door een veel hogere sensitiviteit en specificiteit wat betreft het maken van onderscheid tussen renale en niet-renale hematurie dan de score van het aantal dysmorfe erytrocyten. De conclusie luidt dat met immunocytochemische kleuring van erytrocyten in urine beter dan met de thans gebruikte methoden renale van niet-renale hematurie kan worden onderscheiden.

Inleiding

INLEIDING

Hematurie is een symptoom waaraan niet licht voorbij mag worden gegaan. Hematurie kan het gevolg zijn van ernstige of minder ernstige ziekten, zoals glomerulonefritis, polycystische nieren, carcinoma, stenen, infectie, bloedingsneiging of trauma. De diagnose is in de praktijk niet direct te stellen. Men is in eerste instantie al blij wanneer men snel kan vaststellen of de bloeding haar oorsprong in de nieren heeft, of daarbuiten.

Uiteraard worden bij het onderzoek naar de oorzaak van de hematurie niet-invasieve methoden geprefereerd. Helaas is daarvan maar een beperkt aantal voorhanden, voor het merendeel laboratoriumonderzoekingen, die elk zo hun nadelen hebben. Recentelijk is door Abrass en Laird aannemelijk gemaakt dat erytrocyten in urine die afkomstig zijn van een bloeding in de nier, gecoat zijn met het zogenaamde Tamm-Horsfall-proteïne (THP).1 Erytrocyten in urine bij niet-renale bloedingen bleken weinig of niet met dit eiwit bedekt te zijn.

Tamm-Horsfall-eiwit, ook wel uromoduline genaamd, wordt normaal in aanzienlijke hoeveelheden in de urine uitgescheiden.23 Het THP komt nagenoeg uitsluitend in de nier voor, en wel aan de luminale zijde van het opstijgende deel van de lis van Henle. Een opvallende eigenschap van THP is dat het eiwit zeer gemakkelijk polymeriseert, een verschijnsel dat onder andere wordt tegengegaan door hoge ureumconcentraties en een snelle urinestroom – beide kenmerkend te vinden in gezonde nieren. Genoemde eigenschappen zijn er de oorzaak van dat THP in belangrijke mate voorkomt in cilinders die ontstaan bij nierafwijkingen.4 Waarschijnlijk is ook de coating van erytrocyten bij renale bloedingen een direct gevolg van de bijzondere eigenschappen van dit eiwit.

THP werd door Abrass en Laird door middel van een directe immunofluorescentiekleuring aangetoond op het oppervlak van erytrocyten bij diverse nefrologische aandoeningen, terwijl er geen aanwijzing gevonden werd voor postrenale coating van erytrocyten.1 De coating van erytrocyten met THP zou een nieuwe mogelijkheid kunnen bieden om renale van niet-renale hematurie te onderscheiden. Eerder hebben wij de beschreven directe immunofluorescentiemethode omgezet in een indirecte methode, en deze methode geëvalueerd met enige tientallen patiëntenmonsters.5 Op basis van de kleuring kon zeer goed onderscheid tussen renale en niet-renale hematurie gemaakt worden.5 Om nu uiteindelijk een methode te hebben die gemakkelijk in ziekenhuislaboratoria uitvoerbaar is, hebben wij de immunofluorescentiekleuring gewijzigd in een indirecte immunoperoxydasekleurtechniek. De resultaten verkregen met deze laatste methode, geëvalueerd met behulp van patiëntenmateriaal en vergeleken met onderzoek van de erytrocytenmorfologie, worden in dit artikel meegedeeld.

PATIËNTEN EN METHODEN

Het onderzoek werd verricht met urinemonsters van patiënten van wie op klinische gronden duidelijk was dat zij renale of niet-renale hematurie hadden (tabel). Deze patiënten waren onder behandeling in het Academisch Ziekenhuis St.Radboud of het Canisius-Wilhelminaziekenhuis, beide te Nijmegen. Van patiënten die een niertransplantatie hadden ondergaan werden 2 urinemonsters tegelijkertijd onderzocht: 1 monster afkomstig uit een catheter die was ingebracht in de ureter aangesloten op de getransplanteerde nier en 1 uit een catheter in de blaas, met erytrocyten voornamelijk afkomstig van de urinewegen (onder andere van de operatiewond in de blaas). In deze situatie verkrijgt men uit de eerste catheter in principe erytrocyten die het gevolg zijn van een ‘renale bloeding’, en uit de tweede catheter erytrocyten die het gevolg zijn van een ‘niet-renale bloeding’.

Hematurie werd aanvankelijk vastgesteld met behulp van teststrips die in een urinemonster werden gedoopt. Urinemonsters met relatief weinig bloed (‘microscopische hematurie’) werden door middel van centrifugatie geconcentreerd, relatief geconcentreerde monsters (‘macroscopische hematurie’) werden verdund. Van een deel van het monster werden de erytrocyten qua morfologie verdeeld in ‘dysmorf’ en ‘isomorf’ in een telkamer, zoals beschreven.6 Dit leverde het aantal dysmorfe erytrocyten op: erytrocyten die geen biconcave vorm hebben, hetgeen kenmerkend is voor renale hematurie.

Een ander deel van het monster werd op een glazen microscoop-objectglas gebracht, droogde daarop in en werd gefixeerd met aceton. De gefixeerde objectglaasjes werden immunocytochemisch gekleurd met behulp van een indirecte, met biotine-avidine versterkte immunoperoxydasemethode. Hierbij werd als eerste antilichaam commercieel verkrijgbaar konijn-anti-humaan-THPantiserum gebruikt. Vervolgens werd gebiotinyleerd geit-anti-konijn-antiserum toegepast, en na de reactie werd het geheel in contact gebracht met avidine en gebiotinyleerde ‘horse-radish’-peroxydase. Deze peroxydase gaf door omzetting van aangeboden substraat (waterstofperoxyde) aanleiding tot de vorming van een onoplosbaar donkerbruin gekleurd produkt uit de aanwezige diaminobenzidine. Bij controlemonsters, die steeds werden meegekleurd, werd het anti-THP-anti-serum vervangen door normaal konijneserum. Na kleuring werden de preparaten, al dan niet terstond, onder een lichtmicroscoop bekeken. Voor een uitvoerige beschrijving van de hiertoegepaste methoden wordt verwezen naar elders.5

De berekeningen van sensitiviteit en specificiteit van de tests geschiedden als volgt:7 sensitiviteit = aantalwerkelijk positieve scores(aantal werkelijk positieve aantal fout-negatieve scores); specificiteit = aantal werkelijk negatieve scores(aantal werkelijk negatieve aantal fout-positieve scores). Als werkelijk positief werd een THP-score boven de grenswaarde in een monster van een renale hematurie beschouwd, als werkelijk negatief een score onder de grenswaarde in een monster van een niet-renale hematurie; als fout-positief een score boven de grenswaarde in een monster van een niet-renalehematurie, als fout-negatief een score onder de grenswaarde in een monster van een renale hematurie.

RESULTATEN

Met indirecte immunochemische kleurtechnieken konden wij alleen kleuring verkrijgen indien de urinemonsters waren ingedroogd op objectglaasjes en gefixeerd met aceton. Onze methode week af van die van Abrass en Laird, die uitsluitend werkten met cellen in suspensie.1 De indirecte immunofluorescentiekleuring die wij als eerste invoerden, gaf bij monsters met hematurie van renale afkomst goed herkenbare erytrocyten met helder fluorescerende randen.5 De indirecte immunoperoxydasekleuring die vervolgens operationeel werd gemaakt, bleek alleen tot zichtbaar resultaat te leiden wanneer het kleursignaal versterkt werd met behulp van het avidinebiotine-systeem. Het resultaat van enkele van deze kleuringen wordt in figuur 1 getoond. Erytrocyten in urine afkomstig van renale bloedingen vertoonden na kleuring een donkerbruine rand (zie figuur 1, a), die afwezig was wanneer het anti-THP-antiserum was weggelaten uit de kleurprocedure. Erytrocyten in urine afkomstig van niet-renale bloedingen vertoonden geen donkerbruine randen na immunoperoxydasekleuring (zie figuur 1, b) . Leukocyten en epitheelcellen die soms aanwezig waren in urine van patiënten met renale afwijkingen vertoonden ook een donkerbruin gekleurd celoppervlak. Het resultaat van de indirecte immunoperoxydasekleuring vonden wij superieur aan dat van de indirecte immunofluorescentiekleuring, omdat de eerste methode beelden met meer detail en minder storende achtergrondkleuring opleverde.

De resultaten van de indirecte immunoperoxydasekleuring van erytrocyten in de urine van patiënten met uiteenlopende nefrologische en urologische aandoeningen zijn vermeld in de tabel en bijeengebracht in figuur 2. Steeds kleurde in het geval van bloeding met renale oorzaak het merendeel van de erytrocyten in de urine; gemiddeld was 86 (SD 8,7) van de erytrocyten gekleurd (26 patiënten). Bij niet-renale bloedingen werd daarentegen slechts een minderheid van de erytrocyten in de urine als gekleurd beoordeeld (13; SD 13,5; 21 patiënten). Het gemaakte verschil tussen hematurie van renale oorsprong en van niet-renale oorsprong was significant (p < 0,001, t-toets voor twee steekproeven).

De immunocytochemische kleuringen maakten beter onderscheid tussen hematurie van renale en niet-renale oorsprong dan de beoordeling van de erytrocytenmorfologie. Bij renale hematurieën werd gemiddeld 73 (SD 20,1; 26 patiënten) dysmorfe erytrocyten gezien, bij niet-renale hematurieën 27 (SD 15,7; 21 patiënten). Bij hematurie van renale oorsprong werden wel meer dysmorfe erytrocyten gevonden dan bij hematurie van niet-renale oorsprong, maar de resultaten van beide groepen overlapten elkaar aanzienlijk (zie figuur 2). Deze overlapping trad vooral op bij de groep monsters van transplantatiepatiënten. Wanneer deze monsters buiten beschouwing werden gelaten, werd het verschil in scores aangaande dysmorfe erytrocyten bij hematurieën van renale en niet-renale oorsprong groter: respectievelijk 81 (SD 21,4; 15 patiënten) en 23 (SD 13,6; 11 patiënten). Dit verschil was significant: p < 0,001.

In het voorgaande werd steeds gesproken van renale hematurie. Hiermee werd bedoeld dat er sprake was van bloedingen die echt in de nier waren opgetreden (veelal glomerulaire bloedingen). In feite kan men ook nog van renale bloedingen spreken bij bloedingen die hun oorsprong vinden in het nierbekken. Bij dergelijke hematurieën, waarbij de cellen niet de niertubuli passeren, bleken de erytrocyten niet met THP te worden gecoat. Dit volgde uit het onderzoek van de monsters van 1 patiënt met een pyelumsteen en van 3 patiënten met pyelostomie (zie de tabel). Het gemiddelde aantal met immunoperoxydase kleurende erytrocyten in deze 4 monsters was 6 (SD 5,8). Ook het aantal dysmorfe erytrocyten in deze monsters was gering. Dit resultaat doet vermoeden dat erytrocyten alleen met THP gecoat kunnen worden wanneer ze in de tubuli, in de daar heersende omstandigheden, in contact komen met hoge concentraties van het daar afgescheiden THP. Dit resultaat ligt geheel in de lijn van de bevinding dat ook bij postrenale (dan wel in het algemeen niet-renale) bloedingen geen coating van erytrocyten met THP gezien wordt, ook al is THP wel aanwezig in de urine. In 2 monsters van patiënten die een percutane nefrolithotripsie in verband met een steen in het nierbekken hadden ondergaan, bleken de meeste erytrocyten met immunoperoxydase tegen THP te kleuren (zie de tabel). Bij dit soort hematurie is het echter niet op voorhand duidelijk of de erytrocyten door beschadiging van het nierbekken in de urine zijn gekomen, of door beschadiging van het overige nierweefsel (merg en schors) bij de punctie, zodat aan deze bevinding weinig conclusies mogen worden verbonden.

Van belang voor diagnostische doeleinden zijn uiteindelijk de sensitiviteit en specificiteit waarmee elk der bepalingen renale van niet-renale hematurie onderscheidt. Analyse van de gegevens, met uitzondering van die verkregen bij aandoeningen van het nierbekken, leverde het volgende beeld op (figuur 3). Wanneer men voor de immunocytochemische test een grenswaarde van 60 positief gekleurde cellen neemt, is in het onderzoek zowel de sensitiviteit als de specificiteit voor het onderkennen van renale hematurie 100. Deze opmerkelijk hoge scores zijn een gevolg van het feit dat er bij de aantallen met immunoperoxydase gekleurde erytrocyten van renale versus niet-renale hematurieën vooralsnog in het geheel geen overlapping werd gevonden. Minder gunstige getallen leverde de score van het aantal dysmorfe erytrocyten op (zie figuur 3). Bij een genomen grenswaarde van 30 dysmorfe erytrocyten werd de sensitiviteit voor het onderkennen van renale hematurie 96 en de specificiteit 71. Bij een grenswaarde van 40 dysmorfe erytrocyten waren sensitiviteit en specificiteit respectievelijk 92 en 81, bij 50 als grenswaarde 85 en 86, bij 60 als grenswaarde 69 en 95 en bij 70 als grenswaarde respectievelijk 54 en 100 (sensitiviteit wordt dus ingeleverd voor specificiteit). Sensitiever testen door een grenswaarde lager dan 30 te kiezen is, gegeven onze resultaten, niet reëel, aangezien de specificiteit van de test dan onacceptabel laag wordt (zie figuur 3).

BESCHOUWING

Gezien het relatief geringe aantal mogelijkheden om door middel van onderzoek renale van niet-renale hematurie te onderscheiden, kan het immunocytochemische onderzoek van de erytrocyten in de urine zoals dat hier beschreven is een interessante aanvulling voor de diagnostiek betekenen. In het oorspronkelijke onderzoek, waarin melding gemaakt werd van de coating van THP op erytrocyten in de urine bij renale hematurie, werd gebruik gemaakt van een directe immunofluorescentie-kleurmethode en was het aantal onderzochte patiënten vrij beperkt.1 De anti-THP-antilichamen die bij een directe immunofluorescentiekleuring direct het fluorescentie-label dragen, zijn echter niet in de handel te verkrijgen. Wij hebben de genoemde kleurmethode daarom gewijzigd in een indirecte immunoperoxydasekleuring. Alle voor deze bepaling gebruikte reagentia zijn commercieel verkrijgbaar en voor beoordeling van het resultaat kan gebruik gemaakt worden van een lichtmicroscoop (in plaats van een fluorescentiemicroscoop). Het onderzoek van een gevarieerde groep patiënten met renale en niet-renale hematurie bij wie de diagnose klinisch was vastgesteld, kon de eerder gedane suggestie bevestigen dat bij renale hematurie overtuigend meer coating van erytrocyten in de urine met THP wordt gevonden dan bij niet-renale hematurie. Dit werd geconstateerd met indirecte immunofluorescentiekleuring van materiaal van een grote groep patiënten,5 en zoals hier beschreven met immunoperoxydasekleuring.

Zeer interessant is dat bloedingen opgetreden in het pyelum geen met immunoperoxydase kleurende erytrocyten in de urine bleken op te leveren, zodat een scherp onderscheid tussen zuiver renale (glomerulaire) en postrenale bloedingen mogelijk is. In de huidige omstandigheden zien wij weinig beletsel meer om, onder gecontroleerde condities, tot invoering van immunocytochemische tests op THP over te gaan.

Het meest klassieke laboratoriumonderzoek om renale van niet-renale hematurie te onderscheiden is ongetwijfeld het onderzoek van het urinesediment.8 Dit is direct gericht op de herkomst van bloedcellen in de urine. Ten eerste kan er nagegaan worden of er celcilinders in het sediment voorkomen. Dit wijst erop dat de hematurie het gevolg is van een nieraandoening. Cilinders zijn immers afgietsels van de niertubuli. Cilinders worden echter vaak niet gezien bij het sedimentonderzoek.9-12 Dit is ook onze ervaring. Daarnaast wordt sinds enige tijd ook de inspectie van de morfologie van de erytrocyten in het urinesediment gepropageerd als middel om renale van niet-renale hematurie te onderscheiden. Erytrocyten met vormafwijkingen (dysmorfe erytrocyten) worden geacht kenmerkend te zijn voor renale hematurie. Wij vonden een nadeel van deze test dat de vorm van de erytrocyten verandert wanneer ze zich langer dan circa 3 h in urine bevinden. Hiervan werd bij de immunocytochemische kleuringen geen hinder ondervonden. Het voordeel van beide soorten sedimentonderzoek is daarentegen dat ze met relatief weinig middelen kunnen geschieden en dat de uitslag snel bekend is.

Naast onderzoek van de bloedcellen zelf in het urinemonster worden vaak metingen van de ureum- en creatinineklaring verricht; de vaststelling van proteïnurie geldt als sterke aanwijzing voor de renale herkomst van de hematurie. Uiterst zelden is de proteïnurie van tubulaire oorsprong; in feite is dit slechts een theoretische mogelijkheid.

Het ziet ernaar uit dat met behulp van immunocytochemische kleuring van erytrocyten in urine op THP scherper onderscheid te maken is tussen renale en niet-renale hematurie dan door middel van de score van dysmorfe erytrocyten in de urine. Sensitiviteit zowel als specificiteit van de eerste test is beter dan die van de tweede. Terwijl wij met de immunofluorescentiekleuring in het begin van ons onderzoek bij niet-renale hematurie een paar keer uitschieters met hoge aantallen gekleurde erytrocyten vonden (mogelijk een ‘aanvangsprobleem’),5 werden met de immunoperoxydasekleuring tot nog toe geen uitbijters in positieve of negatieve zin gevonden. Vergelijkenderwijs zou men als nadeel van de immunochemische kleuring kunnen aanmerken dat deze techniek enigszins bewerkelijk dan wel tijdrovend is en dat ze kostbaarder is dan sedimentonderzoek.

Het zal uiteindelijk afhangen van de lokale omstandigheden en behoeften of men het diagnostisch pakket voor renale en urogenitale aandoeningen wenst uit te breiden met immunocytochemisch onderzoek van erytrocyten in urine. Het kan zijn dat men immunochemische kleuring op THP ‘achter de hand’ wil hebben om het gebrek aan gevoeligheid en (of) specificiteit van het urinesedimentonderzoek te ondervangen.

De auteurs danken dr.M.de Metz, klinisch chemicus, en R.I.H.Go, nefroloog, beiden van het Canisius-Wilhelminaziekenhuis, Nijmegen, voor hun bijdrage aan dit onderzoek. Mw.N.Kornaat, dhr.R.Tieleman en mw.I.Beumer, allen werkend in het St. Radboudziekenhuis, Nijmegen, worden bedankt voor hun werkzaamheden bij het vergaren van onderzoeksresultaten.

Literatuur

  1. Abrass CK, Laird CW. Tamm-Horsfall protein coating of freecells in urine. Am J Kidney Dis 1987; 9: 44-50.

  2. Hoyer JR, Seiler MW. Pathophysiology of Tamm-Horsfallprotein. Kidney Int 1979; 16: 279-89.

  3. Kumar S, Muchmore A. Tamm-Horsfall protein –uromodulin (1950-1990). Kidney Int 1990; 37: 1395-1401.

  4. Fairley JK, Owen JE, Birch DF. Protein composition ofurinary casts from healthy subjects and patients with glomerulonephritis. BrMed J 1983; 287: 1839-40.

  5. Janssens PMW, Kornaat N, Tieleman R, Monnens LAH, WillemsJL. Localisation of the site of hematuria by immunocytochemical staining oferythrocytes in urine. Clin Chem 1992; 38: 216-22.

  6. Fassett RG, Horgan BA, Mathew TH. Detection of glomerularbleeding by phase-contrast microscopy. Lancet 1982; i: 1432-4.

  7. Weinstein MC, Fineberg HV. Clinical decision analysis.Philadelphia: Saunders, 1980.

  8. Schumann GB. Cytodiagnostic urinalysis for the nephrologypractice. Semin Nephrol 1986; 6: 308-45.

  9. Gerlach PGG, Koene AP. Het urinesediment bij pijnlozehematurie: een ondergewaardeerd diagnosticum.Ned Tijdschr Geneeskd 1989; 133:1433-6.

  10. Metz M de, Calseyde JF van de. Het urinesediment bijpijnloze hematurie: een ondergewaardeerd diagnosticum.Ned Tijdschr Geneeskd 1989; 133:1804.

  11. Klokke AH. Het urinesediment bij pijnloze hematurie: eenondergewaardeerd diagnosticum.Ned Tijdschr Geneeskd 1989;133: 1804.

  12. Gerlach PGG, Koene RAP. Het urinesediment bij pijnlozehematurie: een ondergewaardeerd diagnosticum.Ned Tijdschr Geneeskd 1989;133: 1804.