Nederlandse Patholoog-Anatomen Vereniging

Vergadering gehouden op 29 oktober 1988 te Groningen

G.J.A.Offerhaus, H.F.A.Vasen, G.Griffioen en E.A.van Slooten (Utrecht), Familiaire adenomateuze polyposis; de waarde van landelijke registratie

Opsporing van het coloncarcinoom in een zo vroeg mogelijk stadium is de enige mogelijkheid om de prognose te verbeteren. Om de opbrengst van screening-programma's zo groot mogelijk te maken is het van belang groepen te onderscheiden met een verhoogd risico. Eén groep wordt gevormd door patiënten met familiaire adenomateuze polyposis (FAP). Zonder periodiek onderzoek ontstaat in 100 van de gevallen bij deze aandoening een coloncarcinoom.

In 1983 is de Stichting Opsporing Erfelijke Tumoren opgericht met als doel screening-onderzoek van families met aanleg voor erfelijke tumoren te bevorderen. Kenmerkend voor de werkwijze van de Stichting is dat centraal persoonsgegevens en medische gegevens worden verzameld terwijl het periodieke onderzoek in de periferie plaatsvindt. Vanuit de Stichting gaat regelmatig bericht naar de specialist om kenbaar te maken dat het tijdstip voor onderzoek is aangebroken. Behalve families met FAP worden ook families met het multipele endocrieneneoplasiesyndroom type II (MEN II) geregistreerd.

Sinds 1984 zijn de gegevens van 78 families met FAP verzameld. Het betreft 220 patiënten en 384 familieleden at risk. Het bleek dat 81 personen at risk niet regelmatig werden gecontroleerd. Zij werden aangespoord zich te laten onderzoeken. Voorts bleek dat 39 familieleden onnodig werden gecontroleerd.

Landelijke registratie leidt tot een kwalitatieve en kwantitatieve verbetering van familieonderzoek. Onderzocht wordt of ook andere erfelijke tumorsyndromen in aanmerking komen voor screening-onderzoek en landelijke registratie.

R.Visser, M.G.Havenith, M.H.Lenders, J.Stouten, J.van Robays, J.Koudstaal, G.Blaauw en F.T.Bosman (Maastricht), Expressie van basale membranen in meningeomen

Basale membranen (BM) komen vrijwel overal voor, op grensgebieden tussen bekledende cellen en het aangrenzende stroma, en rond spier- en vetcellen en Schwann-cellen. In het centrale zenuwstelsel komen BM in bloedvaten voor en in het grensgebied tussen pia en glia limitans externa. Ons onderzoek omvatte de volgende vragen: Hoe is de BM-expressie in zachte en harde hersenvliezen en in meningeomen? Verlenen BM-kenmerken steun aan de veronderstelling dat meningeomen ontstaan uit arachnoïdale cellen? Hoe is de expressie van BM bij in de dura ingroeiende meningeomen? Geeft immunohistochemisch onderzoek van BM aanwijzingen voor de ontstaanswijze van psammoomlichaampjes?

23 meningeomen werden onderzocht. Normaal hersenweefsel (cortex en leptomeninx) werd neurochirurgisch verkregen. Immunohistochemisch onderzoek werd verricht op paraffinecoupes, voorbehandeld met pepsine en guanidine-HCl en gekleurd met een polyklonaal antilichaam tegen collageen type IV en laminine. Transmissie-elektronenmicroscopie werd volgens routineprocedures verricht.

Conclusies

Er is een regelmatige BM-depositie in het grensgebied tussen stroma en pia, resp. arachnoïdale cellen; het overeenkomstige patroon van BM-depositie in arachnoïdale celclusters, granulationes Pacchioni, en in de meeste meningeomen steunt de opvatting dat meningeomen ontstaan uit arachnoïdale cellen; het BM-expressiepatroon wijst op het ontstaan van psammoomlichaampjes zowel uit ‘whorls’ als uit vaatstructuren.

J.M.Kros en C.G.van Eden (Rotterdam), Oligodendroglioma: een vergelijking tussen twee graderingssystemen

In een retrospectief onderzoek werd het in 1983 door Smith gepostuleerde graderingsschema voor oligodendroglioma vergeleken met het algemeen gebruikte schema voor glioma volgens Kernohan. Hiertoe werd aan materiaal van 72 patiënten volgens beide schemata een graad toegekend en overlevingstijden werden vergeleken.

Door middel van variantie-analyse werd aangetoond dat beide graderingswijzen slechts drie groepen patiënten met duidelijk verschillende overlevingstijden kunnen onderscheiden, waarbij de graden B en C volgens Smith, en de graden 2 en 3 volgens Kernohan voor wat betreft de overlevingstijden niet van elkaar te onderscheiden zijn.

Overlevingstijden namen af met toenemen van de leeftijd, maar voor geen van beide graderingsschemata bleken leeftijd en tumorgraad invloed op elkaar uit te oefenen. Evenmin kon een effect van tumorlokalisatie op de overlevingstijden worden aangetoond.

Met voor de prognose als duidelijk onafhankelijk bekende parameters als celdichtheid, pleomorfie en necrose in simpele dichotome scoring, en met reductie van de 4 graden naar 3, verdient het graderingssysteem volgens Smith de voorkeur boven het van Kernohan afgeleide systeem.

W.Melchers, W.Quint, A.van de Brule, J.Walboomers, C.Meijer, M.Burger, P.Herbrink en J.Lindeman (Delft), Opsporing van humaan papillomavirus in cytologisch afwijkende cervix uteri-uitstrijkjes

Om meer inzicht te verkrijgen in het vóórkomen en de rol van humaan papillomavirus (HPV) bij cervix uteri-kanker werden 80 vrouwen met cytologisch afwijkende uitstrijkjes onderzocht op de aanwezigheid van HPV door middel van de gemodificeerde filter-in-situ-hybridisatie (FISH), Southern blot-hybridisatie en door opsporing van ‘in vitro’ vermeerderd viraal DNA, de zogenaamde polymerase chain reaction (PCR).

Bij 56 (70) patiënten werd HPV-DNA gevonden. Bij 19 patiënten die negatief voor HPV waren na onderzoek door middel van de gemodificeerde FISH- en (of) Southern blotanalyse werd alsnog HPV aangetoond door middel van de PCR. Bij 20 van de HPV-positieve patiënten werd meer dan 1 type HPV gevonden. De verdeling van de verschillende HPV-typen over de cytologisch positieve uitstrijkjes staat weergegeven in de tabel.

Uit de resultaten blijkt een sterke betrokkenheid van bepaalde HPV-typen bij de pathogenese van cervixkanker. De rol van HPV zal echter verder onderzocht moeten worden in follow-up-studies bij vrouwen die positief zijn voor HPV of met een cytologisch afwijkende cervixuitstrijk.

J.M.M.Walboomers, A.van de Brule, W.Melchers, W.Quint, E.K.J.Risse, M.de Maine, J.Lindeman en C.J.L.M.Meijer (Amsterdam), Bepaling van humaan papillomavirus in Pap III-uitstrijken met de DNA-amplificatiemethode

De afgelopen jaren is veel onderzoek verricht naar het verband tussen infecties met bepaalde typen humaan papillomavirus (HPV) en baarmoederhalskanker. Vooral infecties met HPV-typen 16, 18, 31 en 33 zouden een verhoogd risico geven-voor het ontstaan van deze aandoening. Om de waarden van HPV-bepaling voor het opsporen van intra-epitheliale neoplasie te bepalen zijn gegevens nodig over het vóórkomen van HPV-typen met verhoogd risico in normale cytologische uitstrijken (Pap III). In de literatuur variëren deze gegevens van 0 tot 45 procent. Er wordt verondersteld dat deze grote variatie wordt veroorzaakt door een aantal factoren, waaronder verschillen in gevoeligheid en betrouwbaarheid van de HPV-bepalingsmethode en de slechte definiëring van de onderzoeksgroep. In dit onderzoek is een begin gemaakt met het nader analyseren van deze twee factoren. Als bepalingsmethode werd de onlangs ontwikkelde DNA-amplificatie(PCR)-methode toegepast. Met deze methode is het mogelijk via een enzymatische reactie één HPV-DNA-kopie per uitstrijk betrouwbaar aan te tonen. Vervolgens werd deze methode toegepast op normale cytologische uitstrijken (n = 125; Pap III) van vrouwen met een laag risico voor het zich ontwikkelen van baarmoederhalskanker. In 5 van de uitstrijken werd HPV gevonden. Twee procent was HPV-611-positief en in 3 werden de HPV-typen met verhoogd risico aangetoond. Deze percentages komen goed overeen met resultaten zoals die eerder werden verkregen met een combinatie van gemodificeerde filter-in-situ-hybridisatie (FISH) en Dot-blot-procedure en zijn aanzienlijk lager dan algemeen in de literatuur worden vermeld. In enkele HPV-16-positieve gevallen werd na 6 maanden al progressie in Pap-klasse waargenomen. Wij zijn bezig met follow-up-onderzoek van deze HPV-positieve gevallen om de rol van HPV bij het ontstaan van baarmoederhalskanker verder te beoordelen.

J.W.Oosterhuis, S.M.M,J.Castedo, B.de Jong, A.Dam, D.Th.Sleijfer en H.Schraffordt Koops (Groningen), Residuaal matuur teratoom na chemotherapie van non-seminoom ontstaat uit een klonale subpopulatie van de primaire tumor

Residuaal matuur teratoom (RMT) is geassocieerd met primaire non-seminomen met een teratoomcomponent. Uit de heterogene structuur van dergelijke tumoren blijkt dat maar een deel van de embryonale carcinoomcellen het vermogen tot somatische differentiatie heeft. Metastasen die afkomstig zijn van primaire non-seminomen zonder somatische differentiatie worden onder invloed van chemotherapie meestal necrotisch en fibrotisch, maar gaan niet over in RMT. Deze bevinding suggereert dat chemotherapie niet in staat is nullipotente embryonale carcinoomcellen tot differentiatie te induceren, maar RMT doet ontstaan door selectie van tumorcellen die tot somatische differentiatie in staat zijn. Deze hypothese hebben we getest met behulp van DNA-flow-cytometrie en chromosomaal onderzoek van primaire non-seminomen en RMT. Als RMT inderdaad uitgaat van (kleine) subpopulaties in de primaire tumor van tumorcellen met het vermogen tot somatische differentiatie, dan mag worden verwacht dat RMT qua ploïdie en karyotype zal verschillen van de primaire tumor.

DNA-flow-cytometrie werd gedaan op morfologisch onderzochte stukjes tumorweefsel waarin alle verschillende componenten van de primaire tumor en het RMT aanwezig waren. Zo mogelijk werden de componenten gescheiden gemeten. Karyotypering werd gedaan m.b.v. Giemsa-gebandeerde metafasen, die werden geoogst na kortdurende weefselkweek.

De ploïdie van RMT is niet duidelijk verschillend van die van de primaire tumor, in 17 van de 24 gevallen zelfs vrijwel gelijk. De karyotypen van 14 primaire non-seminomen en 13 RMT werden met elkaar vergeleken. In 5 gevallen werd zowel de primaire tumor als het RMT van dezelfde patiënt gekaryotypeerd. RMT heeft gemiddeld minder structurele afwijkingen dan een primair non-seminoom, en een kleiner aantal kopieën van de chromosomen 7, 8, 12, 14, X en Y. Algemeen gesproken zijn de karyotypen van RMT minder sterk afwijkend dan die van de primaire non-seminomen. De resultaten steunen de hypothese dat RMT het resultaat is van chemotherapeutische selectie van minder maligne, evolutionair vroege clones in de primaire tumor.

E.C.M.Ooms, A.P.R.Blok en R.W.Veldhuizen ('s-Gravenhage), Argyrofiele proteïnen van Ag-NOR's in overgangsepitheeltumoren

De introductie van een eenvoudige éénstapszilvernitraatkleuring als methode om nucleolar organizer regions (NOR's) aan te tonen in in formaline gefixeerd materiaal, heeft het mogelijk gemaakt de betekenis van deze structuren in de tumorpathologie te onderzoeken. In dit onderzoek is een gedifferentieerde kwantitatieve analyse verricht van Ag-NOR's in 39 overgangsepitheeltumoren. Uit de resultaten blijkt dat kwantitatief onderzoek van Ag-NOR's slechts een beperkte toevoegende waarde heeft bij de gradering van deze tumoren. De waarde van deze gedifferentieerde kwantificering wordt beperkt door problemen met fixatie-artefacten, reproduceerbaarheid van de telling en de selectieprocedure.

H.E.Schaafsma, F.C.S.Ramaekers, G.N.P.van Muijen, E.C.M.Ooms en D.J.Ruiter (Nijmegen), Cytokeratine 8-, 18- en 13-expressie bij de progressie van urotheelcelcarcinomen

Voor het bepalen van de cytokeratine(CK)-expressiepatronen in relatie tot tumorgraad en -stadium werden vriescoupes van 60 urotheelceltumoren (11 G1, 16 G2, 32 G3, 1 inverted papilloom) onderzocht met een reeks van monospecifieke anti-CK-antilichamen, waaronder 2 anti-CK13-(1C7, 2D7)-, 2 anti-CK8-(LE41, M20)- en 4 anti-CK18-(2C8, RGE53, CK18-2, RCK106)-antilichamen. Anti-CK8- en anti-CK18-antilichamen, die verschillende epitopen herkennen, toonden verschillende expressiepatronen. Het CK-expressiepatroon van urotheelcelcarcinomen (UCC) bleek duidelijk van dat in het normale urotheel te verschillen. Dit uitte zich in de expressie van bepaalde epitopen van CK8 en CK18, die normaal alleen in paraplucellen voorkomen, maar die in UCC juist in de invasieve gedeelten ervan ook weer aantoonbaar waren.

Verder werd bij toenemende histologische graad (G3 versus G1 G2) een toename van het relatieve aantal CK18-positieve tumorcellen gezien (met 2C8). Opmerkelijk was echter dat twee G2pT1-tumoren, die met 2C8 grotendeels CK18-negatief waren, juist weer expressie van dit epitoop toonden in de invasieve component. Voor CK13-expressie bleek er een omgekeerde relatie te bestaan, dat wil zeggen afname van expressie bij toename in graad en stadium.

Op grond hiervan menen wij dat veranderingen in het CK-patroon als gevolg van maskering en demaskering van epitopen van CK8 en CK18 eerder samen lijken te hangen met de mate van invasie (dus het T-stadium) dan met de histologische graad. Opheldering van het mechanisme van de veranderlijke CK-epitoopexpressie bij invasieve groei kan belangrijke informatie verschaffen over de pathogenese van tumorprogressie bij UCC.

S.Gratama en H.F.G.M.van den Ingh (Rotterdam), Een 45-jarige patiënte met hevige maagbloedingen als gevolg van een zeldzame vaataandoening

Bij een 45-jarige vrouw zonder voorafgaande maag-darmklachten ontstond een hevige maagbloeding die niet op conservatieve therapie reageerde. Bij herhaald endoscopisch onderzoek werd geen oorzaak gevonden. Angiografie toonde een convoluut van uitgezette arterietakken in de wand van het corpus. De chirurg vond bij laparotomie een beeld als van een ‘arteriokèle’ met kronkelige, verwijde arteriën in de maagwand, maar geen duidelijke bloedingsplaats.

Bij onderzoek van de geheel verwijderde maag kon de patholoog-anatoom evenmin een oorzaak van de bloeding vaststellen. In de submucosa van het fundusgedeelte kwamen gedilateerde arteriën van een opvallend groot kaliber voor met als kenmerkende afwijkingen afzetting van kalk in een gefragmenteerde, klonterig verbrede lamina elastica interna en een fibreuze verbreding van de intima.

Deze vaatwandveranderingen zijn karakteristiek voor pseudoxanthoma elasticum, een erfelijke bindweefselaandoening met manifestaties vooral in de huid, fundus oculi en middelgrote musculeuze arteriën.

Een der arterietakken had de mucosa geërodeerd met als gevolg wandnecrose, trombose en bloeding. De diagnose kon door middel van een huidbiopt worden bevestigd.

De vaatafwijkingen zijn oorzaak van een premature occlusieve arteriopathie welke reeds op jeugdige leeftijd kan optreden. Bloedingen, vooral in maag en duodenum, worden in 14 der gevallen beschreven en vaak reeds bij zeer jonge patiënten. Drost et al. beschreven in 1982 in dit tijdschrift een bijna identieke patiënte.1 De viscerale vaatafwijkingen zijn reeds in 1938 door Prick vermeld.2

G.J.A.Offerhaus, A.S.Pena, R.M.Valentijn, J.Kreuning, C.J.Guyt, J.J.Weening en C.B.H.W. Lamers (Leiden), Campylobacter pylori bij patiënten met een terminale nierinsufficiëntie

Een van de kenmerken van Campylobacter pylori (CP) is de hoge urease-activiteit ervan. Verondersteld is dat de hoge ureumspiegels bij patiënten met een terminale nierinsufficiëntie kolonisatie door CP gunstig kunnen beïnvloeden. Infectie met CP zou in verband staan met de veelvuldig voorkomende maagaandoeningen bij patiënten met uremie. Het doel van onze studie was de frequentie en betekenis van CP-infectie bij patiënten met een terminale nierinsufficiëntie na te gaan. De frequentie van IgG-antistoffen tegen CP in het serum van 50 dialysepatiënten (44) was vergelijkbaar met die van een controlegroep van 40 bloeddonors (45), maar significant lager (p = 0,0001) dan die van 31 patiënten met peptische ulcera en normale nierfunctie (95). Elf van de 50 dialysepatiënten hadden gedocumenteerde peptische ulcera, maar bij hen werden ook in slechts 45 antistoffen tegen CP gevonden. Bij 10 van de dialysepatiënten werd een endoscopie met antrumbiopsie verricht: 2 hadden gastritis en een CP-infectie, bevestigd door microscopisch en serologisch onderzoek; bij 1 patiënt met histologisch normaal slijmvlies was de uitslag van het serologische onderzoek positief, maar van het histologische onderzoek negatief. Van de 31 patiënten met een ulcus en normale nierfunctie had 1 een histologisch normaal maagslijmvlies zonder CP. Alle anderen hadden gastritis en bij histologisch onderzoek CP. Deze studie geeft geen steun aan de hypothese dat uremie predisponeert tot CP-infectie.

G.Brutel de la Rivière (Amsterdam), Lokale bewerking van PALGA-gegevens

Met ‘Select’ beschikt men in het decentrale PALGA-systeem over eenvoudige bestandsbewerkingsmogelijkheden. De combinatie met een personal computer geeft meer mogelijkheden, mits men de gegevens zo consistent mogelijk invoert. Plannen aan de hand van de te stellen vragen en het gebruik van zoveel mogelijk vaste teksten – ook voor namen van inzenders – is daarbij noodzakelijk. Daardoor werd het in ons laboratorium mogelijk uitvoerige jaarverslagen cervix uteri-cytologie met follow-up-onderzoek van dysplasieën te bewerken, interobserver-studies te doen met het cervixcytologiemateriaal en aan de individuele inzenders over hun ingezonden materiaal te berichten; in ons laboratorium bijv. voor de cervixcytologie (ca. 240 inzenders) en de mammapunctiecytologie. Soms is daarbij hulp van de PALGA-centrale nodig of toch nog enig handmatig invoeren van gegevens vanaf PALGA-lijsten. De door PALGA geleverde gegevens zijn immers voor een menselijke lezer geformatteerd en niet voor de computer. Hoewel verschillende database-programma's PALGA-bestanden kunnen inlezen, blijkt soms enig programmeren noodzakelijk, bijv. omdat Amerikaanse programma's data in een ander formaat gieten. Ook voor de follow-up is een vereenvoudiging van de verkregen PALGA-gegevens gewenst, vooral bij grotere aantallen, hetgeen echter meer programmeerwerk vereist. De mogelijkheid om kruistabellen te maken is van belang maar is in sommige database-programma's afwezig. Andere mogelijkheden liggen in het voeren van lokale aanvullende registraties en financiële administraties.

J.van Baarlen, H.-J.Schuurman, R.Reitsma en J.Huber (Utrecht), Acute thymusinvolutie bij kinderen

Bij foetussen en jonge kinderen die na een korte periode van acute ziekte waren overleden, werd histologisch en immunohistochemisch onderzoek aan de thymus verricht. Bij histologisch onderzoek werd de involutie geclassificeerd in 5 graden op geleide van sterrehemelmacrofagen in de cortex, toename van interlobulair interstitium en lymfodepletie van de cortex. De periode van acute ziekte werd benaderd in intervallen van 0-11, 12-23, 24-47, 48-71 en meer dan 72 uur. In een reeks van 234 patiënten bleek een duidelijke correlatie te bestaan tussen involutiegraad en de tijd van de acute ziekte. Deze correlatie was minder duidelijk voor thymusgewicht en volumepercentage van cortex, medulla en interstitium. Deze thymusparameters bleken duidelijk gecorreleerd met prepostnatale status en leeftijd; een dergelijke correlatie werd niet gevonden voor involutiegraad. Bij immunohistochemisch onderzoek van 35 thymussen werd het fenotype van epitheelcellen en lymfocyten nagegaan. In geïnvolueerde thymussen bleken de lymfocyten met het fenotype van thymuscortexcellen en met markers geassocieerd met celproliferatie afwezig. De micro-omgeving van de cortex, met expressie van cortexepitheelmarkers, was echter intact. Wel werden cellen met het fenotype van subcapsulairmedullair epitheel in de cortex gevonden. Subcapsulair epitheel toonde een verlies aan van expressie van thymosine en in de medulla bleken de aantallen HLA-DR-positieve cellen (mogelijk interdigiterende cellen) verminderd.

Conclusie

De thymushistologie tijdens acute involutie is direct gecorreleerd met tijdsduur van acute ziekte en is een betrouwbare maatstaf voor de patholoog-anatoom bij het schatten van deze tijdsduur. Tijdens de acute involutie blijft de corticale epitheliale micro-omgeving intact met verlies van lymfocyten met het fenotype van thymuscortexcellen.

W.Timens, A.Boes, T.Rozeboom-Uiterwijk en S.Poppema (Groningen), De marginale zone in de milt op de kinderleeftijd; samenhang met de te kort schietende immunorespons tegen polysaccharide- en kapseldragende bacteriën

Met behulp van immunohistologische technieken op vries- en paraffinecoupes is onderzoek verricht naar de ontwikkeling en differentiatie van lymfoïde cellen in de verschillende weefselcompartimenten van de milt bij kinderen. Het belangrijkste doel van dit onderzoek is geweest na te gaan of er een relatie is tussen van de volwassen situatie afwijkende kenmerken van (een van de) weefselcompartimenten in de milt, in het bijzonder de marginale zone, en de slechte afweer tegen (bacteriële) polysaccharide-antigenen, zoals gesuggereerd door de resultaten van eerder onderzoek. Na de eerste vijf maanden na de geboorte hebben bijna alle celcompartimenten geheel volwassen kenmerken, behalve de marginale zone, die essentiële verschillen toont t.o.v. de volwassen situatie tot de leeftijd van ongeveer twee jaar. De belangrijkste kenmerken van de marginale zone B-cellen in deze periode (

Ph.M.Kluin, J.K.Kleiverda, J.H.J.M.van Krieken en J.C.Kluin-Nelemans (Leiden), Tumorheterogeniteit in B-cellymfomen; een morfologische studie van biopten in plastic coupes

Omdat classificatie en gradering van maligne lymfomen van klinisch belang zijn en correlatie met prognose bestaat, wordt de hiermee interfererende tumorheterogeniteit het liefst genegeerd. Morfologische heterogeniteit kan op genetische of epigenetische verschillen berusten. We herbeoordeelden 420 in plastic ingebedde biopten van 120 patiënten met een B-cellymfoom of chronische lymfoïde leukemie (CLL) volgens de Kiel-classificatie. In 15 van de 48 gevallen met multipele initiële biopten (meest beenmerg en lymfeklier), werd een duidelijk verschil in morfologie gezien. In 9 gevallen leidde dit bij separate beoordeling tot discrepantie in maligniteitsgraad volgens de working formulation: in 7 gevallen was de maligniteitsgraad in het beenmerg lager, in 2 hoger. In 4 follikelcentrumceltumoren werden beenmerghaardjes gezien die eerder op een immunocytoom duidden. Verandering van maligniteitsgraad gedurende follow-up-onderzoek trad in 21 van de 94 tumoren op. In folliculaire lymfomen werd progressie naar lymfoblastaire, centroblastaire tot plasmablastaire lymfomen gezien. Bij 7 van de 49 patiënten met CLL of immunocytoom was er een vaak terminale toename van blasten. Initiële classificatie van nonHodgkin-lymfomen op grond van beenmergbiopten blijkt zelfs met optimaal histologisch onderzoek van beperkte betekenis te zijn, maar verschaft soms wel klinisch belangrijke informatie over tumorheterogeniteit.

D.de Jong, A.M.H.Voetdijk, G.J.B.van Ommen, J.C.Kluin-Nelemans, G.C.Beverstock en Ph.M.Kluin (Leiden), Translocaties in rijpe B-celtumoren als oorzaak van afwezige immunoglobuline-expressie

Hoewel follikelcentrumcel(FCC)-lymfomen uit rijpe B-cellen bestaan, is bij 10-30 hiervan geen immunoglobuline (Ig) aantoonbaar. Met behulp van Southern blotting en DNA-amplificatie door de polymerasekettingreactie (PCR) werd de rol van de karakteristieke translocaties t(14;18) en t(8;14) in dit defect onderzocht. In 6 van de 19 Ig-zware keten (IgH) negatieve FCC-lymfomen en acute B-celleukemieën werd een t(14;18) gevonden zonder herschikking van een tweede IgH-allel. In 2 cytogenetisch bevestigde gevallen bleken de 2 IgH-allelen betrokken in een t(14; 18) en t(8; 14). In 2 andere gevallen was waarschijnlijk ook sprake van een simultane t(14;18) en t(8; 14) gezien de herschikkingen van bcl-2 en c-myc op chromosoom 18 en 8. In 1 geval met t(14;18) was het andere IgH-allel inactief door herschikking op een pseudo-JH-gen. In 11 van de 19 gevallen was er dus door een of meer translocaties geen functioneel IgH-allel meer beschikbaar en kon afwezigheid van IgH-expressie verklaard worden. In alle 30 controle-IgH-positieve FCC-lymfomen werd een in principe functioneel IgH-allel aangetroffen, al of niet in combinatie met t(14;18) of t(8;14). In 2 gevallen met 1 herschikt IgH-allel en bcl-2-herschikking duidden Southern blot en PCR-analyse voor het t(14;18) breukpunt op een variante bcl-2-translocatie, waarbij het IgH-gen functioneel bleef.

J.W.Cohen Tervaert, R.Goldschmeding, J.D.Elema, M.van de Giessen, M.Huitema, G.K.van der Hem en C.G.M.Kallenberg (Groningen), Crescentic glomerulonefritis is geassocieerd met autoantistoffen gericht tegen verschillende lysosomale enzymen

Verschillende auto-antistoffen tegen lysosomale enzymen kunnen worden aangetoond in sera van patiënten bij wie vasculitis wordt vermoed. De renale manifestatie van een systeemvasculitis (SV) is een lokale, focale extracapillaire, proliferatieve glomerulonefritis met halvemaanvorming (crescentic glomerulonefritis, CGN). CGN wordt echter ook gevonden bij patiënten zonder SV (zg. idiopathische CGN). Om de hypothese te toetsen dat idiopathische CGN behoort tot het spectrum van vasculitiden onderzochten wij de sera van 35 opeenvolgende patiënten met CGN met niet-specifieke immunofluorescentiebevindingen in het nierbiopt. Bij 9 patiënten was sprake van histologisch bewezen ziekte van Wegener (WG), bij 15 patiënten werd op klinische gronden de diagnose ziekte van Wegener gesteld (klinische WG) en bij 8 patiënten was er idiopathische CGN. De overige 3 patiënten hadden CGN secundair aan een infectie. Antistoffen werden bepaald met antigeenspecifieke ELISA's, waarbij monoklonale antistoffen gericht tegen het ANCAACPA-antigeen, myeloperoxydase (MPO) en elastase werden gebruikt. Autoantistoffen tegen deze lysosomale enzymen werden in 32 van de 35 sera gevonden (tabel).

In sera van patiënten met andere nieraandoeningen (n = 41) en van gezonde donors (n = 52) konden deze antistoffen niet worden aangetoond.

Conclusie

Niet-infectieuze CGN is geassocieerd met anti-lysosomale autoantistoffen. Deze antistoffen zijn wellicht een vroeg kenmerk van een systeemvasculitis. Onze gegevens suggereren dat idiopathische CGN behoort tot het spectrum van vasculitiden.

J.A.Bruijn, Ph.J.Hoedemaeker en G.J.Fleuren (Leiden), Anti-basale-membraan-antilichamen in de pathogenese van immuuncomplex-glomerulonefritis

Immunologisch gemedieerde vormen van glomerulonefritis worden op grond van het immunofluorescentiepatroon onderscheiden in immuuncomplexglomerulopathieën en anti-glomerulaire basale-membraan(GBM)-nefritis. In studies aan diermodellen hebben wij aanwijzingen gevonden, dat anti-GBM-antilichamen een pathogene rol kunnen spelen in immuuncomplexglomerulopathie (J Immunol 1987; 139: 2482, Kidney Int 1988; 33: 311, J Lab Clin Med 1988; 111:140). Op basis van deze bevindingen stellen wij dat een relatie bestaat tussen antiGBM-antilichamen en vorming van elektronendichte deposities, volgens drie mechanismen: (1) Een lineaire binding van antilichamen aan moleculen in de GBM kan gevolgd worden door aggregatie en condensatie van de aldus gevormde complexen; (2) Antilichamen kunnen binden aan celbindende epitopen van GBM-componenten, of GBM-voorlopermoleculen op het oppervlak van endotheliale of epitheliale cellen, gevolgd door ‘shedding’ en condensatie; (3) binding van anti-GBM-antilichamen kan gevolgd worden door binding van antilichamen gericht tegen antigenen in ‘coated pits’ van epitheliale of endotheliale cellen, hetgeen op zich door middel van ‘capping en shedding’ aanleiding kan geven tot de vorming van elektronendichte deposities. Wij concluderen, dat het uitsluiten van een pathogene rol van anti-GBM-antilichamen op grond van een niet-lineair distributiepatroon van antilichamen langs de glomerulaire capillairwand onjuist is. Bij patiënten met immuuncomplexglomerulonefritis dient een pathogene rol van anti-GBM-auto-antilichamen te worden overwogen.

J.Grond, M.Coffee, M.Kashgarian en R.B.Sterzel (Groningen en New Haven, USA), De interactie tussen mesangiale cellen en extracellulaire matrix in vitro bij de rat

De interactie tussen mesangiale cellen (MCs) en extracellulaire matrix (ECM) bij de rat werd bestudeerd in vitro na 6 weken kweek, waarbij MCs ‘hillocks’ vormen, noduli-ECM waarin verspreide stervormige MCs en perifeer kleine MCs met een fusiform fenotype, en na 2 weken kweek, waarbij de MCs tweedimensionaal groeien. MC-proliferatie werd bepaald met bromodeoxyuridine (BrdU, 50 µgml medium gedurende 24 uur). De ECM-samenstelling werd bestudeerd met monospecifieke polyklonale antilichamen tegen collageen (C) types I, III, IV, fibronectine (FN), laminine (LM) en trombospondine (TSP). Na 4 dagen rustmedium (0,5 FCS) werden de MCs hierin gelaten of overgezet in groeimedium (20 FCS) gedurende 4 dagen. In rustmedium bleven zowel de fusiforme als stervormige MCs in hillocks BrdU incorporeren (gem. (SD) resp. 9 (3) en 4 (2) op dag 5,p

K.Poelstra, M.J.Hardonk en W.W.Bakker (Groningen), Intraglomerulaire plaatjesaggregatie en verlaagde glomerulaire ADP-ase-activiteit geïnduceerd door perfusie van geactiveerde ontstekingscellen in de rattenier ex vivo

Bij verschillende vormen van experimentele glomerulonefritis (anti-thy-1, anti-GBM-nefritis) treedt influx van granulocyten op in de glomeruli. Bij deze nefritiden is ook een verlaagde glomerulaire ADP-ase-activiteit en verhoogde plaatjesaggregatie waargenomen. Er zijn aanwijzingen dat de ADP-ase-activiteit in de glomerulaire basale membraan van de rat een rol speelt als antitrombotisch mechanisme. Dit enzym is gevoelig gebleken voor zuurstofradicalen. Daar geactiveerde granulocyten zuurstofradicalen produceren, rijst de vraag of deze cellen de oorzaak zijn van de verlaagde ADP-ase-activiteit en verhoogde plaatjesaggregatie bij acute glomerulonefritis. Daarom werd in dit onderzoek de O₂-afhankelijke ADP-ase-aantasting en de intraglomerulaire tromboseneiging bestudeerd na ex vivo-perfusie van ontstekingscelsuspensies in de rattenier (lichtmicroscopie en enzymhistochemie). Door middel van intraperitoneale injectie van 7 ml proteosepepton per rat werden peritoneale exsudaatcellen (PEC) opgewekt in PVGc-ratten. 10 ml PEC-suspensie (7,0 x 10⁵ cellenml buffer (HBSS); 90 granulo-, 10 monocyten) werd geperfundeerd in nieren van PVGc-ratten (ca. 200 g) (flow rate 2 mlmin.; groep I, n = 5). Bij groep II (n = 5) werd 300 µgml superoxide-dismutase (SOD) als O₂-remmer aan de suspensie toegevoegd. Bij controledieren (groep III; n = 5) werd alleen SOD in HBSS geperfundeerd. Direct na perfusie werd een biopt genomen en ingevroren, waarna in dezelfde nier een wisselperfusie werd uitgevoerd met ADP (10 µgml) en humaan plaatjesrijk plasma (2,7x 10⁹ cellenml) volgens standaardmethoden. Coupes uit de biopten en uit nierweefselmonsters na wisselperfusie werden lichtmicroscopisch op genoemde criteria beoordeeld. PEC kunnen worden aangetoond in glomeruli van groep I en II in tegenstelling tot groep III. Maar alleen in groep I is een duidelijke afname van glomerulaire ADP-ase-activiteit en verhoogde plaatjesaggregatie aantoonbaar. De conclusie is dat in dit model geactiveerde PEC in staat zijn tot aantasting van de glomerulaire ADP-ase-activiteit door middel van een O₂-afhankelijk mechanisme. De daarbij waargenomen verhoogde intraglomerulaire stolling bevestigt de functie van dit enzymsysteem als antitrombotisch mechanisme in de glomerulus.

H.Mullink, J.M.M.Walboomers en C.J.L.M.Meijer (Amsterdam), Gecombineerde immuno- en hybridocytochemische en dubbelhybridocytochemische kleurmethode zonder radio-actieve probes, voor de bestudering van virusinfecties

Voor het verkrijgen van een beter inzicht in het verloop van bepaalde virusinfecties op cel- en weefselniveau werd een cytochemische dubbelkleuringsmethode ontwikkeld, waarmee gelijktijdig zowel cellulaire of virale antigenen als virale DNA-sequenties zichtbaar gemaakt konden worden. De methode bestond uit achtereenvolgens een immunoperoxydasekleuring met behulp van DAB en H₂O₂, en in situ-hybridisatie met behulp van gebiotinyleerde DNA-probes. Het gevormde hybride werd zichtbaar gemaakt met een alkalische-fosfatasemethode waarbij BCIP en nitroblauwtetrazolium als substraat gebruikt werden. Op deze manier kon een duidelijk contrast verkregen worden tussen het bruin gekleurde antigeen en het paars gekleurde virale DNA. Op vriescoupes van condylomata konden zodoende de cellen die HPV-611-DNA bevatten nader gekarakteriseerd worden door het intermediaire filamentpatroon. Op paraffinecoupes van de infectieplaats kon worden aangetoond dat cellen die HPV-DNA bevatten lang niet altijd eveneens positief zijn voor virale (late) antigenen.

Bovendien werd een dubbele in situ-hybridisatiemethode ontwikkeld om twee virale DNA-sequenties gelijktijdig zichtbaar te kunnen maken. Hiertoe werd een modelsysteem gebruikt dat bestond uit met HSV-2 geïnfecteerde CaSki-cellen die zelf al HPV-16-DNA in hun genoom geïntegreerd hebben. Een combinatie van gehapteniseerde (met acetylaminofluoreen of sulfonzuur gekoppelde) en gebiotinyleerde DNA-probes kon worden gebruikt. Het beste resultaat werd verkregen met wederom een alkalische-fosfatasekleuring van de gebiotinyleerde hybride (zie boven) en een immunoperoxydasekleuring van de gehapteniseerde probe. Zowel de HSV-2- als de HPV-16-probes konden in beide hoedanigheden gebruikt worden. Met deze methode is het in principe mogelijk om de aanwezigheid van meerdere virussen, en hun eventuele interactie, op cellulair niveau aan te tonen.

F.W.J.Dijkhuis, A.M.Jonker, J.Koudstaal en M.J.Hardonk (Groningen), Rol van perisinusoïdale ‘fat-storing-cellen’ (Ito-cellen) bij de ontwikkeling van granulomateuze structuren in de rattelever

Na een éénmalige intraveneuze injectie van varkensdarm alkalische fosfatase (VAF) in ratten ontstaan granulomen in de lever. Elektronenmicroscopisch worden in deze structuren myofibroblastachtige cellen waargenomen. Onderzocht werd welke rol fat-storing-cellen (FSC, Ito-cellen) spelen bij de vorming van deze structuren. Sinds bekend is dat FSC desmine bevatten, kunnen deze cellen zichtbaar gemaakt worden met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen desmine. Granulomateuze structuren werden opgewekt door intraveneuze injectie van een suspensie die 20 Uml VAF bevatte. Na verschillende tijden werden de dieren gedood. Reticulinevezels werden met een zilverimpregnatiemethode (Gomori) zichtbaar gemaakt. De oppervlaktedichtheid van desminepositiviteit en reticulinevezels werd op cryostaatcoupes van rattelevers gemeten.

Tijdens de ontwikkeling van de granulomateuze structuren, voor het eerst zichtbaar 2 weken na injectie, laat zowel de oppervlaktedichtheid van desmine als van reticuline een sterke toename zien. De hoogste waarde voor desmine wordt na 12 weken bereikt, terwijl die van de reticulinevezels na 39 weken niet meer stijgt. Elektronenmicroscopisch zien we FSC die vetdruppels bevatten, geleidelijk overgaan in myofibroblastachtige cellen waaruit de vetdruppels zijn verdwenen. Beide cellen laten een goed ontwikkeld ruw endoplasmatisch reticulum zien. In de extracellulaire ruimte wordt een toename van collageenvezels gevonden.

Wij concluderen dat FSC een rol spelen in de fibrogenese van granulomateuze structuren in de rattelever.

A.Karrenbeld, M.van Luyn, F.W.J.Dijkhuis en M.J.Hardonk (Groningen), Immunocytochemische typering van MHC-klasse II-positieve cellen in de rattelever na stimulatie

Kupffer-cellen kunnen in vitro fungeren als antigeenpresenterend cellen (APC). Voor de APC-functie is de expressie van MHC-klasse II(Ia)-moleculen echter noodzakelijk. In de normale rattelever zijn Kupffer-cellen Ia-negatief. Pas na inductie van lokale cellulaire ontstekingsreacties worden Kupffer-cellen Ia-positief. De betekenis van deze Ia-expressie in vivo is echter onduidelijk. Met behulp van de ultradunne-vriescoupetechniek en de immunogoudkleuring werd getracht een beeld te krijgen van de Ia-positieve niet-parenchymale celpopulatie in de lever op verschillende tijden na een eenmalige intraveneuze toediening van colloïdale koolstof. Morfologische identificatie werd verkregen door middel van monoklonale antilichamen gericht tegen monqcyten (ED1), macrofagen (ED1, ED2) en lymfocyten (OX8). Het blijkt dat ca. 6 uur na fagocytose van de koolstof Kupffer-cellen Ia-positief worden. Een piek in de Ia-expressie ligt rond 24 uur. Tijdstudies wijzen uit dat Ia-expressie een tijdelijk fenomeen is met een duidelijke afname op dag drie. De met koolstof beladen cellen zijn ED2 . Immuno-elektronenmicroscopische studies van ultradunne vriescoupes tonen aan dat naast de Kupffer-cellen ook niet-fagocyterende, sterk Ia-positieve cellen worden aangetroffen. Voor een deel zijn deze cellen van monocytaire origine (ED1). Van een andere populatie is de herkomst minder duidelijk. Deze cellen hebben de morfologische kenmerken van de zgn. dendritische cel: veelal een sterk onregelmatige kerncontour, multipele projecties van de plasmamembraan, niet-fagocyterend en sterk Ia-positief. In de leversinusoïd zijn dergelijke cellen naar ons weten niet eerder beschreven. Wel zijn lichtmicroscopisch dendritische cellen beschreven in de portale velden van ook normale rattelevers. Het feit dat wij deze cellen aantreffen naast Kupffer-cellen zou een functionele betekenis kunnen hebben. Vooral voor ‘deeltjes’ antigenen die door de niet-fagocyterende dendritische cel niet kunnen worden verwerkt, blijkt de samenwerking met macrofagen noodzakelijk.