Klinische relevantie van resistentie tegen cytostatica bij kinderen met leukemie

Inleiding

De prognose van kinderen met acute lymfatische leukemie (ALL) is de laatste decennia enorm vooruitgegaan door de ontwikkeling van effectieve therapieprotocollen. Momenteel bereikt meer dan 95 van alle kinderen met ALL een complete remissie en blijft circa driekwart van deze kinderen leukemievrij, maar bij circa een kwart treedt tijdens of na de behandeling met cytostatica een recidief van de ALL op. De prognose na zo'n recidief is aanzienlijk slechter, met een overlevingskans van ongeveer 30, maar deze kan hoger of lager zijn afhankelijk van tijdstip en plaats van het recidief.1-5

Er zijn veel prognostische factoren bekend, zoals aantal leukocyten, ‘tumor load’, geslacht, leeftijd, immunofenotype en chromosomale afwijkingen. Wellicht met uitzondering van de tumor load is het echter onbekend waarom deze factoren van prognostisch belang zijn. Bij kinderen met een vergroot risico is dan ook geen rationele therapieverandering mogelijk, waardoor alleen intensivering overblijft. Hiervoor is het noodzakelijk dat geanalyseerd wordt welke factoren uiteindelijk bepalend zijn voor de respons op chemotherapie. Eenvoudig gesteld, hangt deze respons van 2 factoren af:

– De concentratie van cytostatica waaraan de leukemiecellen blootgesteld worden en de tijdsduur van deze blootstelling. Uit een aantal onderzoeken is gebleken dat de serumconcentraties van cytostatica grote interindividuele verschillen vertonen, die van belang zijn voor de prognose.6

– De resistentie van leukemiecellen tegen cytostatica. De kennis hierover is wat betreft kinderen met ALL zeer beperkt. Het is onbekend wanneer, in welke mate en tegen welke cytostatica resistentie optreedt en wat de mechanismen van resistentie zijn bij kinderen met ALL. Een belangrijke oorzaak hiervan was tot voor kort het ontbreken van een geschikte laboratoriumtest waarmee op grote schaal de gevoeligheid voor cytostatica van leukemiecellen van deze kinderen gemeten kon worden. Binnen de afdeling Kindergeneeskunde van het Ziekenhuis van de Vrije Universiteit (VU) is onlangs een dergelijke test ontwikkeld.7-10 In dit artikel worden de resultaten samengevat van het onderzoek naar het klinische belang van het bepalen van de in vitro-resistentie tegen cytostatica bij kinderen met ALL.

Bepaling van cytostatica-resistentie

Leukemiecellen werden verkregen uit beenmerg en (of) bloed van kinderen met ALL uit de celbanken van het kindergeneeskundig research-laboratorium voor hemato-onco-immunologie van het VU-ziekenhuis en de Stichting Nederlandse Werkgroep Leukemie bij Kinderen (SNWLK). Immunofenotypering werd gedaan met een indirecte immunoperoxidasemethode.11 De in vitro-gevoeligheid voor cytostatica werd bepaald met de 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-difenyl-tetrazoliumbromide (MTT)-test.9 In deze test worden leukemiecellen gedurende 4 dagen geïncubeerd in ‘96 wells’-micro-titerplaten die van elk cytostaticum 6 concentraties in duplo bevatten. In 6 controle-wells worden de cellen zonder cytostatica gekweekt. Na 4 dagen wordt MTT toegevoegd. Alleen dan nog levende cellen zijn in staat om MTT om te zetten in het paars gekleurde formazan. De formazanproduktie is recht evenredig met met het aantal levende cellen en wordt gekwantificeerd door de absorptie te meten met een spectrofotometer die gekoppeld is aan een computer voor een efficiënte gegevensverwerking. De leukemische celoverleving wordt berekend door de optische dichtheid van met cytostatica behandelde cellen te delen door die van de cellen zonder cytostatica. Als maat voor resistentie wordt de LC₅₀ gebruikt, dit is de concentratie van een cytostaticum die 50 van de cellen doodt.

Het gebruikte kweekmedium is RPMI 1640 (‘Dutch modification’) met 15 foetaal kalfserum, 100 IUml penicilline, 100 µgml streptomycine, 0,125 µgml amfotericine B, 200 µgml gentamicine, 2 mM glutaminezuur, 5 µgml insuline, 5 µgml transferrine en 5 µgml selenium.9 De overleving van de controlecellen op dag 4 is gemiddeld 67 (23-127).12 Aangetoond is dat in vitro de controleceloverleving niet samenhangt met de cytostaticagevoeligheid.9

Prognostisch belang van cytostatica-resistentie

Een zeer belangrijke vraag is of resistentie tegen cytostatica van prognostisch belang is bij kinderen met ALL. Heeft een kind van wie de leukemiecellen bij diagnose ongevoelig voor een bepaald middel zijn, een grotere kans op een recidief? Om dit na te gaan werd onderzoek verricht met ingevroren cellen van 42 volgens verschillende SNWLK-protocollen behandelde kinderen met ALL die in complete remissie kwamen met een mediane follow-up-duur van 49 maanden. Hieruit bleek dat kinderen bij wie, de leukemie al bij eerste diagnose relatief ongevoelig is voor tioguanine (TG), prednisolon of daunorubicine (DNR), een statistisch significant grotere kans hebben de leukemie terug te krijgen (figuur 1). Dit prognostische belang bleek onafhankelijk te zijn van bekende risicofactoren zoals tumor load, geslacht, leeftijd en immunofenotype. In vitro-resistentie tegen 2 andere middelen, te weten vincristine (VCR) en asparaginase (ASP), blijkt niet van invloed te zijn op de recidiefkans. Dit wijst erop dat in vitro-resistentie tegen een drietal cytostatica, gemeten met de MTT-test, deels de prognose van kinderen met ALL bepaalt.13 Het dient opgemerkt te worden dat dit een retrospectief onderzoek met een relatief klein aantal patiënten betreft, maar ook een in 1989 gestart landelijk prospectief onderzoek bij 117 kinderen met ALL, dat inmiddels is afgerond, maar waarvan de resultaten nog niet zijn gepubliceerd, blijkt de prognostische betekenis van in vitro-resistentie te bevestigen.

Immunofenotype en cytostatica-resistentie

De prognose van een kind met ALL is gedeeltelijk afhankelijk van het type en het rijpingsstadium van de leukemische cellen. Lymfatische cellen kunnen afkomstig zijn uit de B-cellijn of uit de T-cellijn. In de B-cellijn wordt nog een onderscheid gemaakt in 4 opeenvolgende differentiatiestadia: pro-B-ALL, ‘common’ (c)-ALL, pre-B-ALL, B-ALL. Met de huidige therapieprotocollen hebben patiënten met c-ALL en pre-B-ALL de beste prognose, degenen met T-ALL of pro-B-ALL een minder gunstige en degenen met B-ALL de slechtste.314 Een verklaring voor deze verschillen is nog niet voorhanden. In ons onderzoek hebben wij gekeken of resistentie tegen één of meer middelen een verklaring hiervoor kan vormen door bij 84 kinderen met ALL bij diagnose het fenotype te relateren aan in vitro-resistentie tegen 8 cytostatica, te weten prednisolon, ASP, VCR, DNR, cytarabine (CYT), TG, mafosfamide (een actieve metaboliet van ifosfamide) en chloormethine. Enkele voorbeelden van de resultaten zijn te zien in figuur 2. C-ALL en pre-B-ALL bleken inderdaad het gevoeligst te zijn voor cytostatica. Vergeleken met deze cellen bleken T-ALL-cellen significant resistenter tegen prednisolon, DNR, CYT, mafosfamide en ASP. Pro-B-ALL-cellen waren significant resistenter tegen prednisolon, DNR en TG. Van het zelden voorkomende B-ALL-type werden slechts 3 monsters getest, die alle 3 een zeer sterke in vitro-resistentie tegen VCR en DNR vertoonden. Geconcludeerd kan worden dat leukemiecellen van een prognostisch ongunstig immunofenotype of rijpingsstadium inderdaad in vitro ongevoeliger zijn voor een aantal (soms zelfs 5) cytostatica in vergelijking met leukemiecellen van het prognostisch meest gunstige soort. Dit kan derhalve op zijn minst gedeeltelijk het prognostische belang van het fenotype verklaren.15

Leeftijd en cytostatica-resistentie

Het is eveneens bekend dat de leeftijd van het kind ten tijde van het stellen van de diagnose van prognostisch belang is. Kinderen van 1,5 tot 10 jaar hebben de beste prognose; oudere kinderen (> 10 jaar) hebben een slechtere en zeer jonge kinderen (3 1617 Dit zou deels samen kunnen hangen met het feit dat bij de jongste kinderen de leukemie vaker van een ongunstig fenotype pro-B-ALL is.18 De uiteindelijke oorzaak van de invloed van de leeftijd op de prognose is niet bekend. Bij dezelfde 84 kinderen met ALL zijn wij nagegaan of de verklaring te vinden is in cytostatica-resistentie. Cellen afkomstig van de jongste kinderen bleken statistisch significant resistenter te zijn tegen prednisolon en DNR in vergelijking met cellen van kinderen van 1,5 tot 10 jaar (figuur 3). Voor de overige 6 geteste cytostatica werd geen verschil gevonden. Cellen van de oudste kinderen bleken alleen resistenter voor prednisolon te zijn. Ook hier lijkt cytostatica-resistentie derhalve op zijn minst deels een verklaring te vormen voor de relatief slechte prognose in bepaalde leeftijdsgroepen.15

Cytostatica-resistentie bij recidief van acute lymfatische leukemie

Bij eerste diagnose van ALL is de kans om te genezen ongeveer 70-80. Op het moment van een recidief is de kans op genezing aanzienlijk gereduceerd, tot zo'n 30. Hoewel algemeen aangenomen wordt dat het verschil in prognose tussen kinderen met ALL bij initiële diagnose en kinderen met een recidief-ALL (groten)deels veroorzaakt wordt door cytostatica-resistentie in de laatste groep, ontbreekt hiervoor het bewijs. Wij hebben daarom een groep van 108 kinderen met ALL bij initiële diagnose vergeleken met een groep van 29 kinderen met recidief-ALL wat betreft de in vitro-gevoeligheid voor 14 cytostatica. In vergelijking met de groep kinderen bij initiële diagnose blijkt de groep met een recidief-ALL inderdaad significant resistenter te zijn tegen een groot aantal middelen, nl. prednisolon, dexamethason, ASP, DNR, doxorubicine, CYT, TG, mafosfamide, (4-hydroperoxy)-ifosfamide en chloormethine. Er waren geen significante verschillen in in vitro-resistentie tegen VCR, vindesine, teniposide en mitoxantron (tabel). Wellicht zijn deze laatste middelen minder vaak betrokken bij cytostatica-resistentie bij patiënten met een recidief-ALL. Zoals uit de tabel blijkt, wordt de sterkste in vitro-resistentie gevonden tegen de glucocorticoïden prednisolon en dexamethason. Cellen van patiënten met een recidief zijn respectievelijk meer dan 200 en 13 maal zo resistent tegen deze middelen als cellen van patiënten bij diagnose. Voor de andere cytostatica ligt deze resistentieratio tussen 2 en 5.19

In aansluiting op de analyse van beide groepen hebben wij ook de in vitro-resistentie-profielen van individuele patiënten met een recidief-ALL bestudeerd. Het blijkt dat bij sommige patiënten een algemene cytostatica-resistentie voorkomt, terwijl bij anderen een resistentie tegen slechts 1 tot 3 middelen optreedt. Dit suggereert dat voor sommige patiënten geen effectief werkende cytostatica meer beschikbaar zijn, terwijl voor anderen nog wel een effectieve combinatie samengesteld zou kunnen worden.20

Mechanismen van cytostatica-resistentie

Vele resistentiemechanismen worden ontdekt op cellijnen of proefdiermodellen. Voordat bestudeerd wordt of deze werkelijk van klinisch belang zijn, dienen de mechanismen aangetoond te worden op cellen van patiënten. Er bestaat momenteel een groot gebrek aan kennis over de mechanismen die ook daadwerkelijk in vivo een rol spelen bij kinderen met ALL. Een aantal mechanismen hebben wij in ons onderzoeksprogramma bestudeerd.

Het eerste betreft het mechanisme van de ‘multidrug’resistentie (MDR).21 Hierbij worden tumorcellen resistent tegen specifieke groepen cytostatica waartoe VCR en DNR behoren, doordat op de celmembraan het eiwit P-glycoproteïne verschijnt, dat deze middelen de cel uitpompt. Uit ons onderzoek blijkt dat bij kinderen met ALL in vitro-resistentie tegen VCR en DNR altijd gepaard gaat met in vitro-resistentie tegen middelen die niet in het MDR-mechanisme thuishoren. Voorts werd P-glycoproteïne bij geen enkele patiënt aangetoond van wie de cellen hierop onderzocht werden (28 bij initiële diagnose en 14 met recidief) en was de concentratie van VCR en DNR niet verlaagd in de cellen die tegen deze middelen de sterkste in vitro-resistentie vertonen. Kortom, het MDR-mechanisme blijkt niet van belang bij de door ons onderzochte kinderen met ALL. Andere mechanismen moeten dus bij deze kinderen de oorzaak zijn van de resistentie tegen VCR en (of) DNR.20 Onze resultaten komen overeen met die van andere auteurs, die ook slechts bij een zeer klein percentage van kinderen met ALL het P-glycoproteïne konden aantonen.22-24

Andere onderzochte mechanismen hebben betrekking op enzymen die nodig zijn voor activering (hypoxanthine-guanine-fosforibosyl-transferase; HGPRT) dan wel remming (ecto-5‘-nucleotidase; ecto-5’NT) van de cytostatica TG en mercaptopurine. Zowel een lage activiteit van HGPRT als een hoge activiteit van ecto-5‘NT kan theoretisch leiden tot een resistentie tegen TG en mercaptopurine.2526 Hoewel zowel een lage HGPRT- als een hoge ecto-5’NT-activiteit gepaard ging met een slechtere prognose,27 28 bleek dit niet te verklaren te zijn door een relatie met cytostatica-resistentie (figuur 4 en 5).27 29

Modulatie van cytostatica-resistentie

In recente literatuur is gesuggereerd dat onder andere vitamine A, verapamil, lidocaïne, cefarantine en ciclosporine het effect van bepaalde cytostatica op kankercellen zouden kunnen versterken en zo een eventuele resistentie zouden kunnen modificeren.30-32 Wij hebben voor de genoemde middelen bestudeerd of dit inderdaad het geval is bij leukemiecellen van kinderen met ALL. Het blijkt dat al deze middelen op zich cytotoxisch zijn voor ALL-cellen en dat er additionele antileukemische effecten waarneembaar zijn. Het effect van VCR, DNR en TG werd echter niet versterkt door de genoemde middelen, noch bij cellen die afgenomen zijn bij initiële diagnose noch bij cellen van patiënten met een recidiefALL.2033

Conclusies

In het verleden golden als gouden standaard voor in vitro-chemosensitiviteitstests de zogenaamde klonogene tests, waarin gebruik werd gemaakt van prolifererende cellen die in vitro in 2-3 weken gekweekt werden. In het laatste decennium is aangetoond dat tests die gebruik maakten van korte kweektijden (2-4 dagen) en niet-prolifererende cellen zoals de MTT-test minstens even goede correlaties tussen in vitro-gevoeligheid en klinische respons geven als de klonogene tests.1034-39 Deze correlaties tussen in vitro- en in vivo-gevoeligheid vormen het criterium waarop in vitro-tests beoordeeld moeten worden. De klonogene tests hebben niet alleen de praktische nadelen van de lange testduur en de arbeidstijd, ze zijn ook onbruikbaar voor het testen van ALL-cellen afkomstig van patiënten aangezien deze cellen in vitro niet of nauwelijks tot deling aan te zetten zijn. Door de ontwikkeling van de MTT-test is het nu mogelijk geworden om op grote schaal onderzoek te doen naar cytostatica-resistentie bij kinderen met leukemie.

Onze eerste resultaten laten zien dat cellulaire in vitro-resistentie tegen cytostatica inderdaad van groot klinisch belang is. Patiënten bij wie de leukemie bij diagnose in vitro relatief ongevoelig is voor sommige middelen krijgen vaker een recidief dan patiënten bij wie de leukemie in vitro wel gevoelig is voor deze middelen. Op het moment van een recidief-leukemie is deze veelal in vitro resistenter tegen een aantal (soms tegen bijna alle) middelen. De slechte prognose in de groepen met een groot risico, bepaald door leeftijd en type leukemie, blijkt deels te verklaren door resistentie tegen bepaalde cytostatica. Onderzoeken naar mechanismen van resistentie moeten laten zien welke mechanismen wel van klinisch belang zijn en of er methoden zijn om deze resistentie te moduleren.

Inmiddels zijn, in samenwerking met de Stichting Nederlandse Werkgroep Leukemie bij Kinderen en met de Duitse kinderoncologen, met steun van de Nederlandse Kankerbestrijding, 4 landelijke prospectieve onderzoeken gestart, waarbij zowel bij diagnose als bij recidief meerdere aspecten van cytostatica-resistentie bestudeerd worden. Het uiteindelijke doel is om de verkregen kennis omtrent cytostatica-resistentie toe te passen bij de behandeling van kinderen met leukemie. Dit zal wellicht leiden tot de samenstelling van effectievere therapieschema's voor patiënten bij wie nu nog geen curatie mogelijk is. In de tweede plaats kan de verkregen kennis gebruikt worden om de therapie met minder bijwerkingen gepaard te laten gaan. Dit zou mogelijk bereikt kunnen worden door op grond van de MTT-test de niet-werkzame cytostatica weg te laten uit de therapie en alleen effectieve middelen hierin op te nemen, de zogenaamde ‘tailored therapy’. Inmiddels is in internationaal verband een oriënterend onderzoek van start gegaan waarin een groep patiënten met een recidief met een zeer sombere prognose met een dergelijke aangepaste therapie behandeld wordt.

Het beschreven onderzoek wordt ondersteund door de Nederlandse Kankerbestrijding (Koningin Wilhelmina Fonds-toelage IKA 87-17, 89-06 en 90-05, VU 93-641 en VU 94-679) en door het project VONK (VU-onderzoek naar Kinderkanker). Wij danken de Stichting Nederlandse Werkgroep Leukemie bij Kinderen voor de samenwerking bij dit onderzoek. Leden van deze werkgroep zijn: H.van den Berg, dr.J.P.M.Bökkerink, mw. M.V.A.Bruin, dr.P.J.van Dijken, dr.K.Hählen, prof.dr. W.A.Kamps, F.A.E.Nabben, mw.A.Postma, J.A.Rammeloo, mw.I.Risseeuw-Appel, mw.A.Y.N.Schouten-van Meeteren, dr.G.A.M.de Vaan, mw.E.Th.van 't Veer-Korthof, prof. dr.A.J.P.Veerman, mw.M.van Weel-Sipman en dr.R.S.Weening, kinderartsen.