Moleculair-genetisch onderzoek naar draagsterschap van glucose-6-fosfaat-dehydrogenase-deficiëntie

Inleiding

Zie ook het artikel op bl. 1719.

Inleiding

Glucose-6-fosfaat-dehydrogenase (G6PD)-deficiëntie in de erytrocyten is de meest voorkomende erfelijke afwijking in het celmetabolisme: ongeveer 200 miljoen patiënten over de gehele wereld lijden eraan. De ziekte kan in sommige gevallen leiden tot hemolyse. Het gen voor G6PD is gelegen op het X-chromosoom, zodat een deficiëntie meestal alleen bij mannen klinisch manifest wordt. G6PD-deficiëntie geeft enige bescherming tegen malaria; de afwijking komt veel voor bij de bevolking uit het mediterrane gebied, bij Aziaten en bij negroïden.1 Door immigratie krijgt men in Nederland ook steeds meer met deze erfelijke aandoening te maken.

In tegenstelling tot bijna alle andere cellen verliest de rode bloedcel tijdens de ontwikkeling van erytroblast naar erytrocyt het grootste deel van de metabole en synthetische capaciteit. De erytrocyt bezit geen DNA en RNA meer (geen kern, geen ribosomen) en mist daardoor het vermogen tot eiwitsynthese. De erytrocyt bevat ook geen mitochondriën, waardoor geen citroenzuurcyclus in deze cellen plaatsvindt. Als enige intacte stofwisselingsroute blijft de glycolyse over. Een gedeelte van de glucoseafbraak verloopt via het hexose-monofosfaatpad. Hierbij wordt met behulp van G6PD NADPH gevormd, dat reductie-equivalenten levert die nodig zijn voor de omzetting van geoxydeerd glutathion (GSSG) in gereduceerd glutathion (GSH). Het GSH voorkomt en herstelt oxydatie van labiele sulfhydrylgroepen in hemoglbine, membraaneiwitten en enzymen. Het zal duidelijk zijn dat minder stabiele, mutante vormen van G6PD, zonder compenserende synthese, de erytrocyt minder zullen beschermen tegen oxydatieve stress en daarom een kortere levensduur van de cel zullen bewerkstelligen. In andere cellen, waar wel eiwitsynthese plaatsvindt, zal gemuteerd (en daardoor mogelijk labiel) G6PD nog enige bescherming kunnen bieden.

Aanvankelijk werden door biochemische analyse 400 mutanten gekarakteriseerd, maar door de toepassing van moleculair-biologische technieken is dit aantal teruggebracht tot ongeveer 30.23 Sommige G6PD-varianten veroorzaken geen verlaagde enzymactiviteit in de erytrocyten en hebben daardoor geen klinische consequenties. Een 2e categorie G6PD-varianten heeft klinisch wel betekenis, omdat die bij de patiënt een hemolytische anemie kan teweegbrengen. Dit gebeurt echter alleen gedurende de neonatale periode, tijdens infectie, na het eten van tuinbonen of na de inname van bepaalde oxyderende geneesmiddelen.4 Bij een 3e categorie patiënten functioneert de variant van het G6PD-enzym zo slecht, dat de levensduur van de erytrocyt zelfs bij afwezigheid van oxydatieve stress verkort wordt. Deze patiënten hebben een chronische hemolytische anemie zonder sferocyten. Bij draagsters (heterozygoten) van G6PD-deficiënties uit de laatste 2 categorieën kan eveneens acute of chronische hemolytische anemie onstaan.

De diagnose ‘G6PD-deficiëntie’, gebaseerd op G6PD-activiteitsmeting, is gemakkelijk te stellen bij mannelijke patiënten. Dragerschap bij vrouwen is vaak niet op basis van G6PD-enzymactiviteit vast te stellen. Vrouwen die heterozygoot zijn voor G6PD-deficiëntie hebben namelijk 2 erytrocytenpopulaties: een normale en een enzymdeficiënte populatie. Vanwege het lyonisatie-fenomeen, waarbij in het vroege embryonale stadium van vrouwelijke individuen in elke cel de transcriptie van de genen op één van de X-chromosomen uitgeschakeld wordt, kan de normale erytrocytenpopulatie veel groter zijn dan de deficiënte populatie. Deze inactivatie geschiedt immers aselect en kan soms overwegend de X-chromosomen met het mutante G6PD-gen betreffen. Hierdoor ligt de G6PD-activiteit van sommige draagsters dichtbij of binnen het normale gebied. Draagsters voor G6PD-deficiëntie zijn daarom moeilijk te detecteren aan de hand van enzymactiviteitsmetingen. Ook de chroominhibitietest geeft dan niet altijd voldoende zekerheid.56 Deze test meet de glutathionreductaseactiviteit in met chromaat behandelde erytrocyten; in normale cellen wordt deze activiteit dan sterk verminderd, terwijl in G6PD-deficiënte cellen deze grotendeels behouden blijft.

Een juiste diagnose van draagsterschap van G6PD-deficiëntie kan met name consequenties hebben bij zwangerschap van betrokkene, zeker wat betreft voorkómen van een hemolytische crisis door oxyderende farmaca of tijdens infecties. Ook kan men dan bedacht zijn op het pre- en postnataal welzijn van een aangetaste zoon. Draagsterschap voor G6PD-deficiëntie kan eenduidig worden aangetoond met moleculair-genetisch onderzoek van het DNA uit de kernhoudende bloedcellen. Mutaties in het G6PD-gen blijven immers aantoonbaar, ook al is het gemuteerde gen gelegen op een geïnactiveerd X-chromosoom.

Wij hebben een DNA-analyse ontwikkeld waarin 6 mutaties onderzocht worden die volgens de literatuur aan ongeveer vier vijfde van de gevallen van G6PD-deficiëntie ten grondslag liggen.23 Deze 6 mutaties staan vermeld in tabel 1.

Methoden

G6PD-activiteitsmetingen werden uitgevoerd zoals beschreven door Kornberg en Horecker,7 de chroominhibitie volgens de beschrijving van Zürcher en medewerkers.6

Polymerase-kettingreactie

Het al of niet aanwezig zijn van de 6 mutaties werd onderzocht door 5 stukjes genomisch DNA, gelegen rondom de verschillende mutatieplaatsen, te amplificeren met de polymerase-kettingreactie (PCR). Het principe van de PCR is eenvoudig. Een PCR-reactie start met hitte-denaturatie van het dubbelstrengs-DNA, in aanwezigheid van de 4 nucleotiden (adenosine-trifosfaat (ATP), cytosine-trifosfaat (CTP), guanine-trifosfaat (GTP), thymine-trifosfaat (TTP)) en van 2 startfragmenten (zgn. ‘primers’) die ieder complementair zijn aan een plaats in de buurt van een mutatie. Na afkoelen van het reactiemengsel binden de 2 primers zich aan hun complementaire DNA-sequentie. Vervolgens zorgt toegevoegd DNA-polymerase voor verlenging van de gebonden primers. Hierdoor wordt de hoeveelheid DNA gelegen tussen de 2 primers verdubbeld. Verdere cycli van denaturatie, binding van de primers en verlenging van het tussengelegen DNA resulteren in een exponentiële toename van het specifieke DNA-gedeelte dat de betreffende mutatie draagt.

De PCR-primers werden zodanig gekozen dat hetzij de gemuteerde PCR-produkten, hetzij de normale PCR-produkten een knipplaats voor een bepaald restrictieenzym bevatten. Hierdoor kon onderscheid tussen deze PCR-produkten gemaakt worden. Na behandeling met een geschikt restrictie-enzym en elektroforetische scheiding van de stukjes DNA op grootte kon de mutatie bepaald worden.

Voor iedere PCR werd 1 mg genomisch DNA gebruikt, na isolatie volgens standaardmethoden uit de leukocyten van de patiënt.8 Voor onderzoek naar de 6 mutaties werden met het materiaal van elke patiënt 5 PCR's uitgevoerd met de in tabel 2 genoemde primers. Het DNA-Taq-polymerase dat voor de PCR gebruikt werd, was afkomstig van BRL (Breda, Nederland) of Promega (Madison, WI, USA), en de PCR vond plaats in de buffer die voor dat enzym de juiste samenstelling had (BRL of Promega).

De gekozen PCR-omstandigheden waren als volgt: 5 min 95°C, en daarna 35 cycli van achtereenvolgens: 1 min 95°C, 1 min 58°C, 1 min 72°C.

Restrictiefragmentanalyse

Met behulp van restrictie-enzymen werden de PCR-produkten gesplitst in fragmenten.9 Analyse vond plaats met 110 deel van het PCR-produkt, met enzymen van Biolabs (Beverly, CA, USA) en onder de door de fabrikant aanbevolen omstandigheden.

Voor het scheiden van de verschillende restrictiefragmenten werd het minigel-systeem van Biorad (Veenendaal, Nederland) gebruikt. Een polyacrylamide (12,5)-bisacrylamide (0,6)-gel (looptijd: 1 h; voltage: 150) zorgde voor de benodigde scheiding van DNA-fragmenten met een klein grootteverschil. Na elektroforese werden de DNA-fragmenten zichtbaar gemaakt door de gels 30 min te kleuren in een ethidium-bromideoplossing (0,5 mgl).

Patiënten

Om de frequentie van de gevonden mutaties te berekenen werden 78 patiëntendraagsters onderzocht (13 mannen, 65 vrouwen) bij wie op grond van G6PD-activiteitsmetingen ( 0,6 IUg Hb) met zekerheid kon worden gesteld dat zij een homozygote of heterozygote vorm van G6PD-deficiëntie hadden. Daarnaast werd een groep van 51 personen onderzocht bij wie hemolytische anemie door G6PD-deficiëntie werd vermoed (44 vrouwen, 7 mannen), maar bij wie de diagnose met G6PD-activiteitsmeting en chroominhibitietest niet kon worden gesteld: de respectievelijke uitslagen waren namelijk 4,8 IUg Hb en > 0,6 IUg Hb.

Als controlemateriaal werd DNA onderzocht van 50 gezonde bloeddonors (allen vrouwen) bij wie geen hemolytische anemie werd vermoed.

Resultaten

Behandeling met de geschikte restrictie-enzymen liet verschillende fragmenten van de PCR-produkten zien. De grootten hiervan staan vermeld in tabel 1; mutaties zijn aangegeven als verwisseling van een nucleotide door een ander op een bepaalde genummerde genoomplaats of als verwisseling van een aminozuur door een ander op een bepaalde genummerde eiwitplaats. Het polymorfisme op nucleotideplaats (nt) 376 A?G (G6PD A) komt in het algemeen voor ofwel met de mutatie op nt 202 G?A ofwel met de mutatie op nt 968 T?C, en vormt dan de G6PD A-variant. Alléén een mutatie op nt 376, 202 of 968 leidt niet tot een G6PD-deficiëntie, terwijl een combinatie van het polymorfisme met een mutatie op ofwel nt 202 ofwel nt 968 dit wel doet.310

Een voorbeeld van de fragmentlengten op elektroforese-gel na restrictie-enzymanalyse is te zien in de figuur; het beeld moet als volgt worden geïnterpreteerd: het controle-PCR-produkt dat rondom nt 376 is gevormd, wordt door het restrictie-enzym niet gesplitst, zoals te zien is in laan 6: één fragment van 136 baseparen (bp). Het op basis van homozygoot gemuteerd materiaal ontstane PCR-produkt bevat door de mutatie kennelijk een plaats waarop het restrictie-enzym kan aangrijpen, zodat het PCR-produkt wordt gesplitst in 2 fragmenten: een van 56 en een van 80 bp (laan 5). Laan 4 bevat alle 3 fragmenten, de heterozygote situatie. Het is ook mogelijk dat een restrictie-enzym het controle-PCR-produkt wel splitst, maar het mutante produkt niet (zoals bij de PCR-produkten rondom nucleotiden 563 en 968, zie tabel 1).

In totaal werd bij 60 (77) van de 78 G6PD-deficiënte personen 1 mutatie of een combinatie van 2 van de 6 mutaties gevonden die volgens de literatuur tot een G6PD-deficiëntie leiden (zie tabel 1). Het polymorfisme op nt 376, zonder één van de andere mutaties, werd bij 3 va de patiënten gevonden. Bij 19 van de 78 patiënten werd geen van de 6 mutaties gevonden. De percentages gevonden mutaties kwamen bij mannen en vrouwen in grote lijnen overeen.

Bij de 51 personen met een mogelijke G6PD-deficiëntie werd bij 2 een klinisch relevante G6PD-mutatie gevonden (op nt 202 en tevens op nt 376). Dit bevestigt het feit dat verlaagde waarden voor G6PD-activiteit ten gevolge van lyonisatie van het X-chromosoom bij draagsters binnen de normale biologische variatie van G6PD-activiteit kunnen vallen.

Bij de 50 gezonde donors, bij wie geen hemolytische anemie werd vermoed, werd bij 3 (6) de mutatie op nt 202 en tevens op nt 376 gevonden, en bij 1 (2) alleen het polymorfisme op nt 376. Bij navraag bleek dat deze 3 draagsters van G6PD-deficiëntie uit Curaçao of Suriname afkomstig waren, wat de kans op het hebben van een G6PD-variant vergroot.

Beschouwing

Activiteitsmeting van G6PD geeft naar schatting bij 50 van de draagsters geen uitsluitsel over draagsterschap.11 Het is wel mogelijk om na te gaan of bij een vermoedelijke draagster een deel van de erytrocyten geen G6PD-activiteit heeft, dat wil zeggen te bepalen of een zogenaamd mozaïek van G6PD-positieve en -negatieve cellen aanwezig is. Dit kan met behulp van een microscopische nitroblauw-tetrazolium-test aangetoond worden;512 een experimenteel lastige en op individuele interpretatie aangewezen test. Een andere test, de chroominhibitietest, geeft een afgeleide maat van het percentage G6PD-negatieve erytrocyten.56 Hierbij worden intacte erytrocyten behandeld met chromaat. Erytrocyten met voldoende reducerend vermogen inactiveren in aanwezigheid van chromaat het enzym glutathionreductase volledig. Dit reducerend vermogen is aanwezig in de vorm van NADPH, dat alleen gevormd kan worden als er G6PD-activiteit aanwezig is. Zodoende behouden alleen de G6PD-deficiënte erytrocyten hun glutathionreductase-activiteit. Hierdoor is de verhouding van de glutathionreductase-activiteit in wel en niet met chromaat behandelde erytrocyten een afgeleide maat voor het percentage G6PD-negatieve cellen. Naar schatting zal in de chroominhibitietest een draagster als zodanig worden herkend als zij meer dan 30 G6PD-negatieve erytrocyten bezit.5

Beide methoden hebben echter als nadeel dat draagsterschap bepaald wordt aan de hand van de G6PD-activiteit in de erytrocyten en dus sterk beïnvloed wordt door het lyonisatie-fenomeen, dat wil zeggen door het aantal cellen met normale G6PD-activiteit. Dit probleem wordt nog versterkt door een soms verhoogde bloedaanmaak, waardoor bij draagsters in verhouding meer jonge erytrocyten met hogere G6PD-activiteit aanwezig kunnen zijn. Mede daarom wordt bij G6PD-activiteitsmeting altijd gewerkt met de verhouding tussen G6PD en een andere enzymactiviteit waarvan ook bekend is dat de leeftijd van de cellen invloed heeft op de hoogte van de enzymactiviteit. Daarom verdient in principe de voorkeur een aanvullende methode die onafhankelijk van de G6PD-activiteit het draagsterschap aantoont. Zo'n methode is het moleculair-genetisch vaststellen van een mutatie in hot G6PD-gen die tot G6PD-deficiëntie leidt.

Bij vrouwen bij wie hemolytische anemie wordt vermoed, bestaat thans de mogelijkheid om met behulp van moleculair-genetisch onderzoek met zekerheid vast te stellen of zij draagster zijn van G6PD-deficiëntie. Hoewel met de door ons besproken bepalingsmethode de meest voorkomende mutaties worden nagegaan, werd slechts 78 van de mensen met een klinische expressie van G6PD-deficiëntie opgespoord (zie tabel 1). Opsporen van alle relevante mutaties zou inhouden dat bij elke patiënt de nucleotidesequentie van het gehele G6PD-gen bepaald zou moeten worden, hetgeen te tijdrovend en te kostbaar zou zijn. Daarom blijft bepaling van draagsterschap op basis van G6PD-activiteit met behulp van de chroominhibitietest eveneens noodzakelijk. Aangezien deze beide methoden onafhankelijk van elkaar zijn, levert combinatie van de chroominhibitietest en DNA-onderzoek een grotere gevoeligheid op voor het vaststellen van draagsterschap voor G6PD-deficiëntie dan elk van deze tests afzonderlijk. Wij verwachten dat combinatie van beide tests meer dan 90 van de draagsters als zodanig zal kunnen identificeren.

Gezien de kosten ligt het voor de hand eerst de chroominhibitietest uit te voeren en pas bij een normale uitslag daarvan aanvullend DNA-onderzoek te verrichten. De hogere kosten zullen moeten worden afgewogen tegen het belang van correcte informatie voor de patiënt.