Immunologie in de medische praktijk. XXIV. Expressie van antistoffen op bacteriofagen; mogelijkheden voor in-vitroproductie van humane antistoffen met elke gewenste specificiteit

Antistoffen zijn eiwitmoleculen die met hoge affiniteit en specificiteit kunnen binden aan zeer uiteenlopende antigene structuren. Vanwege deze eigenschap worden ze van oudsher beschouwd als potentieel interessante moleculen voor biomedische toepassingen. Aanvankelijk werd gebruikgemaakt van polyklonale antistoffen, verkregen uit het serum van geïmmuniseerde dieren. Een mijlpaal was de ontwikkeling van de hybridoomtechniek in 1975, door Kohler en Milstein. Hiermee werd het mogelijk om in vitro monospecifieke antistoffen te produceren door klonale expansie van antistofproducerende geïmmortaliseerde cellen; deze cellen verkreeg men uit fusies van geïmmuniseerde muizenlymfocyten en -myeloomcellen.1 Deze techniek, die bekroond werd met de Nobelprijs, gaf een geweldige impuls aan het gebruik van antistoffen, zowel in het laboratorium als in de kliniek.

Een belangrijk toepassingsgebied wordt gevormd door de diagnostiek en de therapie van kanker. Hierbij moet men denken aan immuunhisto- en cytochemische detectie en classificatie van maligniteiten, aan immunologische bepalingen van tumormerkstoffen in serum en andere lichaamsvochten, maar ook aan visualisatie in vivo van tumoren en metastasen met radioactief gelabelde antistoffen. Ook in immuuntherapeutisch opzicht bieden antistoffen vele mogelijkheden; zo kan men de specifieke effectorfuncties benutten van hele antistoffen, men kan vaccineren met zogenaamde anti-idiotype-antistoffen (antistoffen gericht tegen het specifieke bindingsgedeelte van andere antistoffen) of men kan antistoffen combineren met chemotherapeutica, toxinen of radio-isotopen en zo deze geneesmiddelen in de buurt van de tumor brengen.2 Deze applicaties zijn alle gebaseerd op de specifieke interactie van antistoffen met aan de tumor gebonden antigenen.

Het aanvankelijke optimisme over de toepassing van monoklonale antistoffen maakte echter geleidelijk plaats voor enige scepsis vanwege inherente bezwaren die aan deze techniek kleven. Zo is het niet alleen bezwaarlijk dat dieren moeten worden geïmmuniseerd en kosten fuseren en subkloneren van de cellen in vitro veel tijd, het is ook moeilijk gebleken om antistoffen te produceren tegen antigenen die geconserveerd zijn tussen mens en dier, of tegen weinig immunogene of toxische substanties. Een belangrijk nadeel is voorts dat therapeutisch gebruik van dierlijke eiwitten vrijwel altijd leidt tot een neutraliserende, soms schadelijke immuunrespons bij de humane recipiënt, waardoor de antistoffen bij herhaald gebruik ineffectief worden. Het produceren van humane antistoffen heeft deze problemen niet kunnen oplossen, aangezien dit een technisch moeilijke procedure is met bovendien een vrij geringe opbrengst van antistoffen van IgM-isotype en met een lage affiniteit.3 Voorts is het vaak niet mogelijk om over geïmmuniseerde humane lymfocyten te beschikken en worden op deze wijze geen antistoffen tegen autoantigenen verkregen.

Dankzij moleculair-biologische ontwikkelingen kunnen bestaande muizenantistoffen nu herleid worden tot partieel humane DNA-sequenties (figuur 1), hetgeen echter technisch complex blijft en soms ten koste gaat van de bindingseigenschappen van de verkregen preparaten.4 De ontwikkeling van faagtechniek in het afgelopen decennium biedt daarentegen ongeëvenaarde mogelijkheden voor het produceren van volledig humane antistoffen, met elke gewenste bindingskarakteristiek.

bacteriofaag

Een faag (synoniem: bacteriofaag) is een filamenteus virus dat zich kan repliceren in Escherichia coli. De lengte ervan is circa 1-2 ?m en de diameter 6-7 nm. Het genoom van een faag bestaat uit circulair enkelstrengs-DNA met een lengte van ongeveer 6400 basen, samen 10 genen omvattend, die vooral coderen voor virale manteleiwitten. De replicatiecyclus van het virus begint met infectie van E. coli door specifieke binding van het virion via het p3-eiwit, dat in 3-5 kopieën aanwezig is aan het uiteinde van de faag, aan de zogenaamde F-pilus van de bacterie, waarna insertie plaatsvindt van het virale DNA in de bacterie. Met behulp van enzymen van de bacteriële gastheer wordt dan van het enkelstrengsfaag-DNA dubbelstrengs-DNA gevormd, waarvan boodschapper-RNA (mRNA) afgeschreven wordt voor productie van virale manteleiwitten. Deze eiwitten worden getransporteerd naar de bacteriële celmembraan en de cyclus eindigt door extrusie van viraal enkelstrengs-DNA uit de bacterie onder simultane assemblage van de manteleiwitten tot het virion. Hierbij wordt de gastheercel niet gelyseerd, zodat multipele kopieën van het virus geproduceerd worden in één infectiecyclus.5

fagen met antistoffen op het oppervlak

In 1985 beschreef Smith het kunstmatig tot expressie brengen van peptiden aan het faagoppervlak: de DNA-sequentie die codeert voor het gewenste peptide wordt geligeerd aan de DNA-sequentie in het faaggenoom die bijvoorbeeld codeert voor het p3-eiwit, waardoor na replicatie in E. coli een fusie-eiwit gevormd wordt, dat zich na assemblage van het virion bevindt aan het faagoppervlak, gekoppeld aan het p3-eiwit.6

Sindsdien zijn ook grotere eiwitten tot expressie gebracht, waaronder als eerste ook antilichamen.7 Verschillende technische ontwikkelingen maakten dit mogelijk. Zo werden de onderliggende mechanismen van immuunglobulinevariabiliteit, die berust op herschikking van immuunglobulinegenen tijdens de antistofrespons in vivo, verder ontrafeld. Tegelijkertijd werden steeds meer basensequenties van deze genen bekend. Met deze sequenties kon men oligonucleotideprimers ontwerpen die nodig waren om de genen via de polymerasekettingreactie (PCR) te amplificeren; in dit geval werd een ‘reverse’-transcriptase-PCR gebruikt omdat het genetisch uitgangsmateriaal mRNA was, geïsoleerd uit B-lymfocyten. Het aldus verkregen cDNA kon vervolgens via recombinanttechnieken (waaronder fusie van het cDNA met het 5'-uiteinde van het p3-gen), gekloneerd worden in faagvectoren waarmee men het cDNA in E. coli-bacteriën kon brengen. Die bacteriën brachten vervolgens de bedoelde antistoffen gekoppeld aan het p3-eiwit tot expressie (aan het N-terminale deel van het p3-eiwit), zonder dat dit ten koste ging van het specifieke infecterend vermogen van de fagen voor E. coli. Daarnaast bleken variabele domeinen van antistoffen goed geproduceerd te worden in het periplasma van E. coli.8

Essentieel bij expressie op fagen is dat dankzij de insertie van het coderende gen van de antistoffen in het faaggenoom, en expressie van het fusie-eiwit aan het faagoppervlak, genotype en fenotype in één fysieke structuur gekoppeld zijn (de faag). Men kan aldus met faagantistofexpressie de humorale arm van het immuunsysteem nabootsen. De rol van B-cel wordt hierbij vertolkt door het faagpartikel, dat gemodificeerd is om te coderen voor een immuunglobuline gepresenteerd op het oppervlak.

Dankzij een technisch foefje is het daarnaast mogelijk om oplosbare antilichamen te produceren. Hierbij wordt namelijk tussen het antistofgen en het p3-gen van de bacteriofaag een stopcodon geïntroduceerd.9 Dit zal in sommige E. coli-stammen leiden tot translatiebeëindiging, waardoor het antistofmolecuul niet als p3-fusiecomplex op de faag tot expressie zal komen, maar als oplosbaar product zal worden uitgescheiden in het bacteriekweekmedium. In andere stammen kan dit stopcodon onderdrukt worden, waardoor toch volledige, antistofdragende faagpartikels worden gevormd. Aldus bepaalt de keuze van de E. coli-stam of er expressie is van de antistoffen op het faagoppervlak, dan wel secretie in het kweekmedium (figuur 2). Hierdoor wordt een verdere verfijning van het ‘in-vitro-immuunsysteem’ bereikt: de eerstgenoemde mogelijkheid staat model voor de B-cel, de laatstgenoemde bootst de plasmacel na die antistoffen uitscheidt.

bibliotheken van faagantistoffen

Inmiddels zijn, dankzij het bepalen van de sequenties van de meeste variabele antistofketens van zowel muis als mens, sets van zogenaamde consensus-oligonucleotideprimers (‘universele primers’) ontworpen, waarmee nagenoeg alle bestaande antistofsequenties door PCR geamplificeerd kunnen worden. Dit heeft als voordeel dat men niet meer beperkt is tot het kloneren van een enkele monoklonale antistof, maar als bron van antistofgenen ook willekeurige muizenlymfocyten of humane lymfocyten kan gebruiken, hetgeen resulteert in een zeer grote diversiteit aan antistofgenen. Aldus is het nu mogelijk om zogenaamde bibliotheken (synoniemen: banken, repertoires) van antistoffen te produceren en tot expressie te brengen op fagen (zie figuur 2).10

Dankzij de eenmalige constructie van een antistoffenbibliotheek kunnen, zonder voorafgaande immunisering en zonder celfusie of subkloneren, in relatief korte tijd volledig humane antistoffen met doorgaans goede affiniteit tot elk gewenst hapteen, eiwit of andere antigene structuur geïsoleerd worden.

selectie, screening en modificatie van antilichamen

Het succes van antistofexpressie op fagen is niet alleen afhankelijk van de beschikbaarheid van een stabiele, grote en diverse faagantistofbibliotheek, maar bovenal van het vermogen om antistoffen daadwerkelijk uit een dergelijk repertoire te isoleren. Hiertoe zijn diverse methoden ontwikkeld, die als gemeenschappelijk kenmerk hebben dat meerdere selectieronden nodig zijn om de specifiek bindende antistoffen van het veelvoud aan andere bindende specificiteiten te scheiden. Een standaardselectieronde ziet er als volgt uit (figuur 3): het antigeen in kwestie wordt, meestal na binding (‘coating’) aan een vaste drager, zoals een ELISA-plaat of een immunotube, geïncubeerd met de complete faagantistoffenbank (dit heet ‘pannen’ of ‘biopanning’). Nadat de faagpopulatie gedurende enige tijd de gelegenheid gehad heeft om aan het antigeen te binden, worden de niet-gebonden fagen door multipele wasstappen weggespoeld. Daarna wordt de specifiek gebonden populatie van de drager losgemaakt (geëlueerd) met een geconcentreerde zure of basische oplossing en kan deze door re-infectie van E. coli geamplificeerd worden. Deze faagpopulatie, die zodoende verrijkt is voor elementen die aan het antigeen kunnen hechten, wordt vervolgens onderworpen aan een hernieuwde selectieronde. Iedere ronde levert een 100- tot 1000-voudige verrijking op, zodat na 3-4 ronden een miljardvoudige verrijking op specifieke bindende fagen kan worden bereikt. Een selectieronde kan binnen 2 dagen voltooid worden, zodat men in een week of twee de gewenste antistoffen in voldoende hoeveelheid in handen heeft.11

Tal van variaties op dit thema zijn denkbaar en betreffen zowel de wijze waarop het antigen aangeboden wordt aan de faagpopulatie als de manier waarop specifieke bindende fagen geëlueerd worden. Na meerdere selectieronden wordt de verkregen populatie gescreend op specifiek bindende fagen. In principe bestaat screening uit het groeperen van de verkregen klonen op basis van hun, door digestie met restrictie-enzymen bepaalde, genetische profiel, gevolgd door een simpele, betrouwbare en reproduceerbare bindingsassay aan het antigeen, met representanten van de verschillende subgroepen. Meestal wordt een ELISA op zuiver antigen, of op hele doelwitcellen gebruikt voor oriënterende screening. Daarnaast kunnen analyse met een ‘fluorescence-activated cell sorter’ (FACS), of immuuncyto- en/of histochemische bepaling gebruikt worden. Laatstgenoemde technieken leveren extra informatie op over de specificiteit van de binding.

De gewenste applicatie kan het nodig maken de geselecteerde antistoffen te modificeren wat betreft affiniteit, valentie, specificiteit of effectorfuncties. Ook hierbij staat faagexpressie centraal, waarbij dankzij de eerder beschreven koppeling van feno- en genotype in de faagvector simultaan met de selectie van de antistoffen de antistofgenen die hiervoor coderen ter beschikking komen.

conclusies

Uit het voorgaande zal duidelijk zijn dat de nog jonge techniek van antistofexpressie op fagen grote potentie heeft voor het isoleren, manipuleren en produceren van specifiek bindende moleculen voor toepassing in onderzoek en kliniek.

Dankzij de beschikbaarheid van grote antistofbibliotheken is het voortaan mogelijk om in kort tijdsbestek, met relatief simpele selectiemethoden, zonder voorafgaande immunisatie, celfusie of -klonering, specifieke volledig humane antistoffen met goede affiniteit te isoleren tegen elk denkbaar antigeen, inclusief geconserveerde of autoantigenen, weinig immunogene stoffen of toxische substanties.

Door de fysieke koppeling van feno- en genotype in de faagvector is het vervolgens relatief eenvoudig om affiniteit, formaat, valentie, specificiteit of effectorfunctie van de geselecteerde antistoffen via moleculaire technieken te modificeren, op maat voor elke gewenste toepassing. Tot slot is het systeem uitermate geschikt voor grootschalige productie in E. coli. Dankzij dit alles is antistofexpressie op fagen een techniek waarvan onderzoekers, clinici, farmaceutische industrie en vooral patiënten in de nabije toekomst veel profijt zullen hebben.