Hybridocytochemie; nieuwe mogelijkheden voor detectie en lokalisatie van nucleïnezuren in microscopische preparaten

Klinische praktijk
M. van der Ploeg
A.K. Raap
P. van Duijn
Citeer dit artikel als
Ned Tijdschr Geneeskd. 1990;134:1084-9
Download PDF

Inleiding

De moleculaire biologie van nucleïnezuren maakt sinds de vijftiger jaren een spectaculaire ontwikkeling door. In 1953 ontdekten Watson en Crick dat DNA, de drager van de erfelijke informatie, een draadvormig molecuul is met een dubbele helixstructuur. De strengen die samen de dubbele helix vormen, bestaan uit een fosfodesoxyriboseketen waaraan, in een specifieke volgorde, de basen adenine, thymine, guanine en cytosine zijn gekoppeld. De basenvolgorde van de beide strengen is complementair: tegenover adenine ligt steeds thymine en tegenover guanine steeds cytosine. Van dit vermogen tot vorming van dubbele helices wordt gebruikt gemaakt om nucleïnezuurketens met een specifieke basenvolgorde in extracten van weefsels en cellen op te sporen. Men moet dan beschikken over een stuk DNA of RNA (de ‘probe’) dat een basenvolgorde bezit die complementair is aan die van de nucleïnezuursequentie die men in het extract wil aantonen (de ‘target’).

Deze methode werd in 1961 ontwikkeld door Spiegelman, en wordt sindsdien in het moleculair-biologisch onderzoek op grote schaal toegepast. In 1969 werd van dit principe door Gall en Pardue gebruik gemaakt om bepaalde nucleïnezuursequenties in een cel- of chromosoompreparaat ook onder de microscoop te detecteren en te lokaliseren.1 De twee strengen van het aan te tonen DNA-molecuul werden hiervoor eerst gescheiden (de zgn. denaturatie). Vervolgens werd de probe, een enkelstrengs radioactief gemerkt nucleïnezuur met een basenvolgorde complementair aan die van het te lokaliseren DNA, met het microscopische preparaat in contact gebracht onder bepaalde omstandigheden van zoutgehalte en temperatuur, waardoor exclusieve binding met de op te sporen DNA-sequentie in het preparaat plaatsvond. Daarbij vormden zich opnieuw dubbelstrengs moleculen (hybriden), die konden worden aangetoond met autoradiografie. Dit gebeurde door boven het preparaat een fotografische emulsie aan te brengen, waarin als gevolg van het radioactief verval van de nucleïnezuurprobe, door middel van fotografische ontwikkeling boven het hybride molecuul zilverkorrels werden gevormd.

Deze methode, door Gall en Pardue in situ-hybridisatie genoemd, maakte het mogelijk onder de microscoop, in een individuele cel of chromosoom, specifieke fragmenten nucleïnezuur aan te tonen en te lokaliseren. De methode heeft in deze vorm, omdat met radioactieve isotopen moet worden gewerkt, enkele bezwaren die brede toepassing in de microscopische diagnostiek in de weg staan.

Deze bezwaren kunnen ondervangen worden door aan de nucleïnezuurprobe een fluorescerende kleurstof te koppelen (figuur 1). Hierdoor wordt de plaats van de gevormde hybride in het preparaat direct onder de fluorescentiemicroscoop zichtbaar. Als eersten slaagden Bauman, Wiegant en Van Duijn erin nucleïnezuren op deze wijze te merken met behoud van hun specifieke hybridisatiemogelijkheden.2 Zij gebruikten gefluorochromeerde RNA-probes die qua basensamenstelling complementair waren aan target-DNA-sequenties, aanwezig in cellen en weefsels. Met behulp van deze zogeheten directe methode konden virusdeeltjes in geïnfecteerde weefselkweekcellen, en een aantal genen in de reuzenchromosomen van Drosophila, goed gelokaliseerd worden. Sindsdien heeft niet-radioactieve in situ-hybridisatie, die ook wel hybridocytochemie wordt genoemd, zich snel ontwikkeld. Voor het lokaliseren van DNA-maar ook van RNA-sequenties zijn momenteel verschillende methoden beschikbaar. De meeste hiervan zijn ‘indirecte’ methoden waarbij de DNA-probe is voorzien van een immunologisch detecteerbare groep. Voorbeelden zijn de merking van DNA met biotine3 of met een hapteen zoals acetylaminofluoreen,4 een sulfongroep,5 of digoxigenine.6

Een belangrijk voordeel van de op deze wijze gemodificeerde probes is dat ze – in vergelijking met radioactief gemerkte nucleïnezuren – zeer stabiel zijn en in principe onbeperkt houdbaar. De ontwikkeling van deze alternatieve probe-merking heeft vooral een hogere detectiegevoeligheid opgeleverd.

Methodologische aspecten

Om het microscopische preparaat voor optimale morfologische beoordeling zoveel mogelijk intact te houden en er tegelijk voor te zorgen dat het te lokaliseren nucleïnezuur bereikbaar is voor de probe, dienen de preparaten bepaalde voorbewerkingen te ondergaan.

Fixatie

Zoals bij vrijwel elke cytochemische reactie gericht op de detectie van intracellulaire componenten, dient het cel- of weefselpreparaat gefixeerd te worden om verval van celcomponenten door autolyse en daarmee verlies van de morfologische structuur tijdens de diverse incubaties te voorkomen. Voor in situ-hybridisatie zijn in het algemeen geen bijzondere fixatiemethoden nodig.

Verhoging van de toegankelijkheid

De aan hapteen gekoppelde probe en het hapteen-specifieke antilichaam, waarmee target-nucleïnezuursequenties moeten worden gedetecteerd, zijn macromoleculen, waarvoor de cel- en weefselstructuur toegankelijk moet worden gemaakt om efficiënte detectie te bewerkstelligen. Dit gebeurt door het preparaat voor te behandelen met proteasen zoals pepsine of proteïnase K.

Gevoeligheid

Bij een bespreking van de gevoeligheid is het goed zich te realiseren dat het humane haploïde genoom uit slechts 3 picogram (pg) DNA (3.10-12 g) bestaat. Toch heeft deze uiterst geringe hoeveelheid een complexiteit van zo'n 3.106 kilobasen (kb). Als men dus een unieke DNA-sequentie van bijv. 3 kb in een cel of chromosoom detecteert, dan betekent dit dat ongeveer 3 miljoenste van een pg DNA zichtbaar gemaakt wordt. Zoals in figuur 2 te zien is, waar 2,8 kb van het humane thyroglobuline-gen zichtbaar is gemaakt, kan met hybridocytochemie deze zeer hoge gevoeligheid inderdaad bereikt worden. Dat is in principe eenvoudiger via de autoradiografische techniek, omdat daarbij de duur van de belichting de mate van zwarting van de fotografische emulsie en daarmee (althans ten dele) de gevoeligheid bepaalt. Detectie van een nucleïnezuursequentie via een fluorochroom of enzym geeft over het algemeen echter een beduidend nauwkeuriger microscopische lokalisatie dan autoradiografie.

Bruikbaarheid voor de detectie van DNA-sequenties

Omdat de detectiegrens van de niet-autoradiografische methoden bij 2-3 kb ligt, zijn deze al goed toepasbaar in situaties waarbij meerdere kopieën van een bepaalde gensequentie aanwezig zijn in een cel, zoals bij virusinfecties (figuur 3) of gen-amplificatie (figuur 4). Verder is het met de niet radioactieve methoden eenvoudiger om meerdere specifieke sequenties in een preparaat tegelijk zichtbaar te maken (figuur 5). Men merkt daarbij iedere probe verschillend en kleurt vervolgens de gevormde hybriden met verschillende fluorochromen of enzymen.78 Kleurstoffen en fluorochromen lenen zich bovendien goed voor snelle en nauwkeurige kwantificering met cytometrische apparatuur.

Hoewel de bovengeschetste hybridocytochemische procedure complex lijkt, is ze in vele opzichten analoog aan de in de diagnostiek veelvuldig toegepaste immunocytochemische methoden.9 Bovendien is er de laatste jaren voor een aantal hybridocytochemische toepassingen goed uitgewerkte receptuur ontwikkeld. Mede in verband met het in toenemende mate (ook commercieel) beschikbaar komen van reeds gemerkte probes en detectiesystemen is dus een brede toepassing in diagnostisch en overig biomedisch onderzoek te voorzien.

Bruikbaarheid voor de detectie van mRNA-sequenties

In fundamenteel celbiologisch onderzoek, maar ook in cel- en weefseldiagnostiek kan beantwoording van de vraag, in welke cellen en waar in die cellen, en op welk moment, transcriptie van specifieke DNA-sequenties in mRNA plaatsvindt, van groot belang zijn. Radioactieve in situ-hybridisatie is reeds op vrij grote schaal toegepast om mRNA te lokaliseren op cellulair niveau. Nog weinig is gepubliceerd over niet-radioactieve methoden voor de lokalisatie van mRNA. De weefsel- en celpreparatie is hier zeer kritisch door de labiliteit van mRNA en de storende aanwezigheid van RNAse. Niettemin zijn op dit terrein reeds goede vorderingen gemaakt.10-12

Toepassingen

Virologie

Voor het detecteren van virusdeeltjes in microscopische preparaten van cellen en weefsels kan men met behulp van immunocytochemische methoden eiwitcomponenten van het virus aantonen. De hybridocytochemische methoden maken het mogelijk de nucleïnezuurcomponent van virussen aan te tonen, waardoor viraal genetisch materiaal in individuele cellen kanworden gelokaliseerd. Deze microscopische benaderingen betekenen een belangrijke diagnostische aanwinst voor virussen die met de gebruikelijke celkweektechnieken moeilijk aan te tonen zijn.1314 Voor veel virussen wordt de immunocytochemische methode reeds op ruime schaal toegepast. Voor de diagnostiek van infecties met virussen waarvoor (nog) geen specifieke antisera beschikbaar zijn maar wel nucleïnezuur-probes, vormen de hybridocytochemische methoden een nog grotere aanwinst.

Dat hybridocytochemie en immunohistochemie beide in staat zijn in weefsel een virale infectie aan te tonen voordat de histopathologische kenmerken zichtbaar worden, bleek uit een recente studie van Jiwa et al., die aantoonden dat cytomegalovirus frequent voorkomt in longen van transplantatiepatiënten met interstitiële pneumonitis zonder karakteristieke cytopathogene kenmerken.15 Ook voor andere virusinfecties begint de hybridocytochemische diagnostiek haar waarde te bewijzen. Met deze techniek werden bijvoorbeeld herpes simplex-virus type I bij encefalitis,16 het als JC-virus bekend staande Papova-virus bij patiënten met progressieve multifocale leuko-encefalopathie,17 en EpsteinBarr-virus bij Burkitt-lymphoma18 geïdentificeerd. Nucleïnezuren worden in het algemeen met de in de histopathologie gebruikelijke formaldehydefixatie en paraffine-inbedding goed gepreserveerd. Materiaal dat verscheidene jaren in de archieven van pathologische laboratoria was bewaard, bleek bijvoorbeeld nog bruikbaar voor het aantonen van viraal genoom.1920 Dit vergroot de diagnostische toepasbaarheid van de techniek. Daarvoor is ook van belang dat voor een aantal virussen, zoals adenovirus, cytomegalovirus, hepatitis- en herpes simplex-virussen, DNA-probes reeds commercieel verkrijgbaar zijn.

Studies van virusinfecties op celniveau openen ook de mogelijkheid iets meer te zeggen over de relatie tussen virusinfecties en oncogenese. Onlangs is geopperd dat er een oorzakelijk verband zou kunnen zijn tussen cancerogenese in de cervix uteri en infecties met het humane papilloma-virus (HPV).21 Van dit virus blijken in cervixcarcinomen vooral de typen HPV-16 en HPV-18 voor te komen. Met behulp van in situ-hybridisatie kon in weefselcoupes van cervixcarcinomen worden aangetoond dat het HPV-DNA uitsluitend in de maligne cellen, en niet in bindweefselcellen van het stroma aanwezig is.22 Studies aan cellijnen afkomstig van cervixcarcinomen hebben duidelijk gemaakt dat vele ervan HPV-16- of HPV-18-positief zijn, en dat in alle HPV-positieve cellijnen het virus-DNA in het humane genoom is geïntegreerd. Met deze resultaten is echter nog niet bewezen dat HPV's de oorzaak zijn van het ontstaan van cervixcarcinoom. Onderzoek naar de relatie tussen virusinfecties en neoplasie in individuele cellen kan meer inzicht verschaffen in de betekenis van HPV bij de pathogenese van het cervixcarcinoom.23

Cytogenetica

Voor de diagnostiek van genetisch bepaalde afwijkingen worden zowel morfologische als moleculair-biologische methoden toegepast. Grove afwijkingen in aantal en structuur van de chromosomen kunnen in mitotische cellen opgespoord worden met klassieke celkweek- en kleurtechnieken. Kleurmethoden die in de chromosomen een bandenstructuur zichtbaar maken, hebben hier tot een zekere verfijning geleid. Niettemin zijn deze technieken vooral gericht op de uitwendige vorm en niet op de moleculaire samenstelling van de chromosomen. Thans zijn er echter talrijke DNA-probes beschikbaar die stukken DNA herkennen die specifiek voorkomen in een bepaald chromosoomsegment. Met behulp van deze probes is het mogelijk duplicatie, amplificatie, deletie of translocatie van chromosoomonderdelen in meer detail te bestuderen. Bovendien zijn onlangs banken van probes beschikbaar gekomen die over de gehele lengte van een chromosoom complementaire sequenties herkennen. Na de hybridisatie wordt het chromosoom dan vrijwel geheel gekleurd. Verwacht mag worden dat met behulp van een voor chromosoom 21 specifieke set probes de diagnose Down-syndroom bij prenataal onderzoek bespoedigd en vereenvoudigd zal kunnen worden.24 Er openen zich eveneens mogelijkheden voor prenatale diagnostiek in de maternale bloedcirculatie, via de daarin sporadisch aanwezige foetale cellen.

Nieuw bij deze benadering is dat deze chromosoomspecifieke probes het mogelijk maken ook in nietdelende cellen – in de interfasekernen – specifieke chromosomen of chromosoomonderdelen te lokaliseren. Dit is een belangrijke vooruitgang, aangezien karyotypering tot nu toe slechts mogelijk was in spontaan delende of tot deling gestimuleerde celpopulaties. Op deze manier kunnen in cel- of weefselpreparaten numerieke chromosoomafwijkingen, die karakteristiek kunnen zijn voor bepaalde typen gezwelgroei, worden aangetoond.

Hieraan zal nog kunnen bijdragen dat er momenteel computergestuurde microscopen beschikbaar zijn die op basis van ultrasnelle beeldanalyse in staat zijn in bloeduitstrijkjes specifiek gekleurde cellen te detecteren, ook als er slechts een enkele afwijkende cel op meer dan een miljoen normale cellen voorkomt.25 Nu drie of meer chromosoom-specifieke DNA-sequenties in een celkern tegelijkertijd via verschillende kleuren zijn te visualiseren,7 kan in een preparaat met een combinatie van probes een combinatie van chromosomen of chromosoomonderdelen in interfasekernen worden onderzocht.26

Naast de lokalisatie van grotere stukken chromosoomspecifiek DNA (die voor het merendeel waarschijnlijk voor meer dan één eiwit coderen), is het zoals hierboven beschreven, ook mogelijk gebleken kleinere enkel-gensequenties in chromosomen zichtbaar te maken. Bij een patiënt bij wie chronische myeloïde leukemie werd vermoed, en waarbij met de klassieke chromosoombandering geen duidelijke translocatie van het Philadelphia-chromosoom te herkennen was, kon, gebruikmakend van een DNA-probe ter grootte van 1,8 kb, vastgesteld worden dat er wel degelijk sprake was van een translocatie van het zogenaamde abl-oncogen van chromosoom nr.9 naar chromosoom nr. 22.27 Zoals bekend, heeft deze translocatie de over-expressie van dit gen en de ongeremde groei van de myeloïde cellen tot gevolg.

Diagnostiek van tumoren

Microscopisch onderzoek van gezwelgroei, geïnitieerd door Virchow, heeft inzicht verschaft in de complexiteit van de cancerogenese. Volgend op de initiële transformatie van enkele cellen, ontwikkelen zich, in interactie met hun omgeving, tumoren die gekarakteriseerd zijn door zowel een moleculair als een cellulair zeer complex patroon.28

Cytochemische kleuring van de hoeveelheid DNA en cytometrische bepaling van het totale DNA-gehalte in kernen van individuele tumorcellen, bracht aan het licht dat in sommige tumoren de cellen een sterk afwijkend DNA-gehalte hebben, terwijl in andere tumoren het DNA-gehalte in de celkern niet meetbaar was veranderd. Dit verschil bleek bij bepaalde typen tumoren prognostische betekenis te hebben.29 Thans kan echter door toepassing van chromosoom-specifieke DNA-probes een veel nauwkeuriger inzicht verkregen worden in de chromosomale veranderingen die het genoom van de tumorcellen tijdens de voortgaande ontwikkeling van een tumor ondergaat.

Hybridocytochemisch onderzoek op celkernen met een combinatie van chromosoom-specifieke probes toonde aan dat in kernen van bepaalde tumoren een veel complexere herschikking van het genoom was opgetreden dan uit DNA-metingen het geval leek. Vooral voor het onderzoek aan solide tumoren (waaruit vaak onvoldoende delende cellen worden verkregen) biedt deze karyotypering belangrijke voordelen boven de bestaande karyotypering op metafasen. De diagnostische en prognostische betekenis van genetische aberraties in het genoom van tumorcellen kan aldus goed worden onderzocht. Bij een eerste onderzoek aan blaascarcinoomcellen bleek dat in een aantal gevallen cellen met een ogenschijnlijk diploïde DNA-inhoud, voor bepaalde chromosomen numerieke afwijkingen toonden.30

Een belangrijk bijkomend voordeel is dat met deze techniek ook retrospectief onderzoek mogelijk is aan celkernen uit in paraffine ingebed tumormateriaal. De verwachting is dat uit dit soort onderzoekingen prognostisch belangrijke gegevens kunnen worden verkregen.

Beschouwing

Door middel van het gebruikelijke histologische en cytologische onderzoek is in de loop der jaren een schat van gegevens verkregen over de morfologie en indirect ook over de fysiologie en het gedrag van cellen, al of niet in weefsel- of orgaanverband. De nieuwe hybridocyto-chemische methoden, gebaseerd op moleculair-biologische principes, maken het mogelijk deze gegevens in directe relatie te brengen met de spectaculaire vorderingen op het terrein van de moleculaire biologie van nucleïnezuren. Deze ontwikkeling zal nog gestimuleerd worden door recente voortgang op het terrein van het microscopisch onderzoek in het algemeen. Geautomatiseerde ultrasnelle herkenning en meting van celkenmerken behoort thans tot de mogelijkheden. Cytometrische patroonherkennende apparatuur is in staat cytochemisch gemerkte bloedcellen die in een coupe of celuitstrijkje aanwezig zijn in frequenties van slechts één op de miljoen, snel en nauwkeurig te detecteren en te tellen.25 Dit opent geheel nieuwe mogelijkheden voor de detectie van nog beginnende virusinfecties en voor cytogenetische diagnose op basis van slechts enkele cellen. Het biedt ook perspectieven voor verdere verfijning van de tumordiagnostiek.

Doorslaggevend voor een brede toepassing van de nieuwe methoden zal, naast snelheid en kosten, vooral de diagnostische winst zijn die ze kunnen leveren in vergelijking met klassieke morfologische methoden. Slechts uitgebreid verkennend onderzoek kan hierover uitsluitsel geven.

Literatuur
  1. Gall JG, Pardue ML. Formation and detection of RNA. DNAhybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci USA 1969;63: 378-83.

  2. Bauman JGJ, Wiegant J, Borst P, Duijn P van. A new methodfor fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by insitu hybridization of fluorochrome labeled RNA. Exp Cell Res 1980;128:485-90.

  3. Langer PR, Waldrop AA, Ward DC. Enzymatic synthesis ofbiotin labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc NatlAcad Sci USA 1981: 78: 6633-7.

  4. Landegent JE, Jansen in de Wal N, Baan RA, HoeijmakersJHJ, Ploeg M van der. 2-Acetylaminofluorene-modified probes for the indirecthybridocytochemical detection of specific nucleic acid sequences. Exp CellRes 1984; 153: 61-72.

  5. Sverdlov ED, Monastyrskaya GS, Guskova LI, Levitan TL,Scheichenko VI, Budowsky EI. Modification of cytidine residues with abisulfite-O-methylhydroxylamine mixture. Biochem Biophys Acta 1974; 340:153-65

  6. Aischler H, Nanda I, Schaefer R, Schmid M, Epplen JT.Digoxigenated oligonucleotide probes specific for simple repeats in DNAfingerprinting and hybridization in situ. Hum Genet 1989; 82:227-33.

  7. Nederlof PM, Robinson D, Abuknesha R, et al. Three-colorfluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiplenucleic acid sequences. Cytometry 1989; 10: 20-7.

  8. Mullink H, Walboomers JMM, Raap AK, Meyer CJLM. Two colourDNA in situ hybridization for the detection of two viral genomes usingnon-radioactive probes. Histochemistry 1989; 91: 195-8.

  9. Bosman FT. Nieuwe methoden in de pathologische anatomie.Ned Tijdschr Geneeskd 1989; 133:606-13.

  10. Lawrence JB, Singer RH. Intracellular localization ofmessenger RNAs for cytoskeletal proteins. Cell 1986; 45: 407-15.

  11. Bresser J, Evinger-Hodges M. Comparison and optimizationof in situ hybridization procedures yielding rapid, sensitive mRNAdetections. Gene Anal Techn 1987; 4: 89-104.

  12. Dirks RW, Raap AK, Minnen J van, Vreugenhil E, Smit AB,Ploeg M van der. Detection of mRNA molecules coding for neuropeptide hormonesof the pond snail Lymnaea stagnalis by radioactive and non-radioactive insitu hybridization: a model study for mRNA detection. J Histochem Cytochem1989; 37: 7-14.

  13. Grody WW, Cheng L, Lewin KJ. In situ viral DNAhybridization in diagnostic surgical pathology. Hum Pathol 1989; 18:535-43.

  14. Jiwa NM, Raap AK, Rijke FM van de, et al. Detection ofhuman cytomegalovirus antigens and DNA in tissues fixed with formaldehyde. JClin Pathol 1989; 42: 749-54.

  15. Jiwa NM, Steenbergen RDM, Zwaan FE, Kluin PM, Raap AK,Ploeg M van der. Three sensitive methods for the detection of cytomegalovirusin lung tissue of patients with interstitial pneumonitis. Am J Clin Pathol1989; (ter perse).

  16. Burns J, Redfern DRM, Esiri MM, McGee JOD. Human andviral gene detection in routine paraffin embedded tissue by in situhybridisation with biotinylated probes: viral localisation in herpesencephalitis. J Clin Pathol 1986; 39: 1066-73.

  17. Boerman RH, Arnoldus EPJ, Raap AK, Peters ACB, Schegget Jter, Ploeg M van der. Diagnosis of progressive multifocal leukoencephalopathyby hybridisation techniques. J Clin Pathol 1989; 42: 153-61.

  18. Sixbey JW, Nedrud JG, Raab-Traub N, Hanes RA, Pagano JS.Epstein-Barr virus replication in oropharyngeal epithelial cells. N Engl JMed 1984; 310: 1225-30.

  19. Brigati DJ, Myerson D, Leary JJ, et al. Detection ofviral genomes in cultured cells and paraffin-embedded tissue sections usingbiotinlabeled hybridization probes. Virology 1982; 126: 32-50.

  20. Raap AK, Geelen JL, Meer JWM van der, Rijke FM van de,Boogaard P van den, Ploeg M van der. Non-radioactive in situ hybridizationfor the detection of cytomegalovirus infections. Histochemistry 1988; 88:367-73.

  21. Beckmann AM, Meyerson D, Daling JR, Kivat NB, FenoglioCM, McDougall JK. Detection and localization of human papillomavirus DNA inhuman genital condylomas by in situ hybridization with biotinylated probes. JMed Virol 1985; 16: 265-73.

  22. Walboomers JMM, Melchers WJG, Mullink H et al.Sensitivity of in situ detection with biotinylated probes of human papillomavirus type 16 DNA in frozen tissue sections of squamous cell carcinoma of thecervix. Am J Pathol 1988; 131: 587-94.

  23. Schegget J ter. Papillomavirus en cervix uteri-carcinoom.Ned Tijdschr Geneeskd 1989; 133:967-71.

  24. Pinkel D, Landegent J, Collins C, et al. Fluorescence insitu hybridization with human chromosome specific libraries: detection oftrisomy 21 and translocation of chromosome 4. Proc Natl Acad Sci 1988; 85:9138-42.

  25. Ploem JS. Modern image analysis methods in hematology.Nouv Rev Fr Hematol 1988; 30: 45-9.

  26. Nederlof PM, Flier S van der, Raap AK, Ploeg M van der,Kornips F, Geraedts JPM. Detection of chromosome aberrations in interphasetumor nuclei by non-radioactive in situ hybridization. Cancer Genet Cytogenet1989; 42: 87-98.

  27. Ambros PF, Bartram CR, Haas OA, Karlic H, Gadner H.Non-isotopic in sity hybridization for mapping oncogenic sequences. In: NethR, Gallo RC, Greaveo MF, Janka J, eds. Modern trends in human leukemia.Berlin: Springer, 1989.

  28. Bishop JM. The molecular genetics of cancer. Science1987; 235: 305-11.

  29. Rodenburg CJ, Cornelisse CJ, Fleuren GJ. De betekenis vanDNA-flow-cytometrie bij solide tumoren.Ned Tijdschr Geneeskd 1989; 133:814-8.

  30. Hopman AHN, Ramaekers FCS, Raap AK, et al. In situhybridization as a tool to study numerical chromosome aberrations in solidbladder tumors. Histochemistry 1988; 89: 307-16.

Auteursinformatie

Rijksuniversiteit, Sylvius Laboratorium, Laboratorium voor Cytochemie en Cytometrie, Wassenaarseweg 72, 2333 AL Leiden.

Prof.dr.M.van der Ploeg, dr.A.K.Raap en prof.dr.P.van Duijn, celbiologen-cytochemici.

Contact prof.dr.M.van der Ploeg

Gerelateerde artikelen

Reacties