De polymerase-kettingreactie
Open

Stand van zaken
16-09-1989
E.P.J. Arnoldus, N.M. Jiwa, A.C.B. Peters en A.K. Raap

Gedurende de laatste twee jaar is in dit tijdschrift een aantal artikelen gewijd aan nieuwe technieken in de medische research. De materialen en de methoden van de moleculaire genetica,12 en de nieuwe methoden in de pathologische anatomie werden behandeld.34 In navolging hiervan willen wij in dit artikel ingaan op de polymerase-kettingreactie (‘polymerase chain reaction’, PCR). In het kort worden de theoretische achtergronden van de PCR en enkele experimentele toepassingen, in het perspectief van bestaande diagnostische methoden, besproken.

De essentie van deze moleculair-biologische techniek is de mogelijkheid tot snelle in vitro-amplificatie van een stuk nucleïnezuur: in slechts enkele uren tijd kunnen miljoenen kopieën van een specifiek stuk DNA gemaakt worden. Sinds de eerste publikatie van Saiki et al. in 19855 wordt deze techniek nu op vele terreinen van medische research toegepast.

PRINCIPE

Het DNA van elk organisme heeft zijn eigen unieke nucleotidenvolgorde (sequentie). De nucleotiden bestaan uit een suiker, een fosfaatgroep en een specifieke base, namelijk adenine, thymine, cytosine of guanine. Het DNA is opgebouwd uit twee complementaire nucleotidenstrengen, waarbij tegenover adenine in de ene streng altijd thymine in de andere streng ligt en tegenover guanine altijd cytosine. De waterstofbruggen tussen deze basenparen houden de beide complementaire strengen bijeen. Als men het DNA verhit, verbreekt men de waterstofbruggen en valt het DNA uiteen in twee losse strengen; dit proces heet denaturatie. Twee enkelstrengs DNA-moleculen kunnen bij lagere temperatuur weer renatureren tot een dubbelstrengs molecuul, mits de beide strengen complementair zijn.

Centraal in de PCR staat het enzym DNA-polymerase, dat een enkelstrengs DNA-molecuul als matrijs kan gebruiken om daartegen een complementaire streng te synthetiseren. Het enzym heeft hiervoor wel bepaalde opstapplaatsen in de vorm van een stukje dubbelstrengs DNA nodig. Als de sequentie van het DNA dat men wil amplificeren bekend is, is het mogelijk voor ieder van de beide strengen op gedefinieerde afstand een ‘primer’, een klein complementair stukje DNA, te maken. Indien men aan gedenatureerd DNA een overmaat van deze primers toevoegt en vervolgens de temperatuur verlaagt, zullen de primers op de beide strengen binden. Vanaf deze opstapplaatsen kan het DNA-polymerase vervolgens nieuwe complementaire strengen vormen. De polymerase-kettingreactie bestaat uit het vele malen herhalen van de cyclus van denaturatie, primerbinding en ketenvorming (figuur 1).

Na de eerste cyclus zijn er door het DNA-polymerase twee nieuwe strengen gevormd. Deze nieuwe strengen worden gekenmerkt door een vast beginpunt, namelijk de ingebouwde primer. Bij de tweede cyclus worden ook tegen deze strengen nieuwe strengetjes gevormd. Deze nieuwe strengetjes bezitten nu naast een vast beginpunt ook een vast eindpunt. Bij opeenvolgende cycli verdubbelt het aantal van die strengetjes steeds, zodat men in feite een exponentiële toename van een DNA-fragment met een vaste grootte krijgt (figuur 2).

PRAKTISCHE ASPECTEN

Het polymerase-kettingreactiemengsel bestaat uit losse nucleotiden, primers, DNA-polymerase, buffer en het DNA dat men wil onderzoeken. Aanvankelijk werd het Klenow-fragment van het DNA-polymerase I van de bacterie Escherichia coli als enzym bij de PCR gebruikt. Aangezien dit enzym bij de verhitting tijdens de denaturatie te gronde ging, moest na iedere cyclus nieuw polymerase worden toegevoegd. Met de isolatie van een thermostabiel DNA-polymerase uit de bacterie Thermus aquaticus (Taq),6 die in heetwaterbronnen voorkomt, behoort dit probleem tot het verleden. Men kan nu volstaan met een enkele toediening van dit Taq-DNA-polymerase bij de start van de PCR, hetgeen de reactie goedkoper, betrouwbaarder en gemakkelijker automatiseerbaar heeft gemaakt.7 De cyclus van denaturatie (bijv. 1 minuut bij 95°C), primerbinding (bijv. 2 minuten bij 55°C) en ketenvorming (bijv. 1,5 minuut bij 70°C) wordt doorgaans 20-40 keer doorlopen.

Het geamplificeerde stuk DNA kan men vervolgens eenvoudig aantonen door een deel van het reactiemengsel op een agarose-gel aan te brengen en het DNA door elektroforese op grootte te scheiden. Na afloop van elektroforese en na kleuring met ethidiumbromide is het zien van een bandje op de juiste hoogte in de meeste gevallen voldoende bewijs dat amplificatie heeft plaatsgevonden en dat het betreffende DNA dus in het uitgangsmateriaal aanwezig was (figuur 3). De specificiteit van de PCR wordt bij deze onderzoekmethode bepaald door de keuze van de sequenties van de twee primers en hun onderlinge afstand. De kans dat een primer voor 100 past op een ander stuk DNA dan het gewenste, is zeer gering. Indien er onverhoopt toch aspecifieke bindingsplaatsen voor beide primers zouden bestaan, moet de afstand tussen de primers ook nog precies gelijk zijn om een geamplificeerd stuk DNA van dezelfde grootte op te leveren. Voor (nader) onderzoek kan het PCR-produkt ook op een nylon filter aangebracht worden door middel van dot-blot of Southern-transfer.2 Op dit filter wordt vervolgens een hybridisatie met een radioactief gelabeld DNA-fragment uitgevoerd. Deze probe is precies complementair aan een gedeelte van het DNA dat men heeft willen amplificeren. Indien na autoradiografie blijkt dat de probe inderdaad op het PCR-produkt heeft gehybridiseerd, is dit een (extra) bewijs dat de juiste amplificatie heeft plaatsgevonden (figuur 4). Onder andere bij het opsporen van puntmutaties wordt deze benadering met filterhybridisatie veelvuldig toegepast.8

Naast het gemak van uitvoering en de beschreven specificiteit is de kracht van de PCR vooral gelegen in de zeer grote gevoeligheid. Saiki et al. konden het ?– globine-gen met 40 PCR-cycli aantonen in een verdunning van 1 cel mèt dit gen op 1.000.000 cellen zonder dit gen.7 Deze enorme gevoeligheid is tegelijkertijd ook de achillespees van de reactie. Zeer geringe contaminaties bij de opwerking van de monsters (aërosolen!) kunnen reeds tot fout-positieve resultaten leiden. Door de juiste technische maatregelen te treffen kan dit probleem ondervangen worden. Bovendien zal voor vele toepassingen de uiterste gevoeligheid niet nodig zijn.

TOEPASSINGEN IN DE VIROLOGISCHE DIAGNOSTIEK

De huidige routinematige, virologische diagnostiek steunt vooral op kweekmethoden, immunocytochemische technieken, elektronenmicroscopie en serologie. De laatste jaren is er een aantal experimentele technieken bij gekomen die gebaseerd zijn op het aantonen van het DNA of RNA van virussen, zoals filterhybridisatie en in situ-hybridisatie. De nieuwste loot aan deze stam is de PCR. In het algemeen zijn de voordelen van de PCR de grote gevoeligheid, de snelheid en het gemak van de reactie. De waarde van de PCR in de virologische diagnostiek zal in vergelijkende onderzoekingen beoordeeld moeten worden. De PCR wordt daartoe tegenwoordig vaak als experimentele bepaling in de virologische diagnostiek toegepast.9 Vooral bij virusinfecties waarbij snelle behandeling van groot belang is, kan de snelheid van de PCR-bepaling een groot voordeel zijn. Zo waren in een klinisch onderzoek van Jiwa et al. bij patiënten die beenmerg- en niertransplantaties ondergingen, infecties met cytomegalovirus (CMV) eerder en (of) langer aantoonbaar met behulp van de PCR dan met een snelle kweekmethode.10 Als snelle bepaling lijkt de PCR ook geschikt voor de bewaking van de anti-virustherapie.

De gevoeligheid van de PCR is met name van belang, als in het van patiënten afkomstige materiaal weinig infectieuze viruspartikels aanwezig zijn. Bij patiënten bij wie herpes simplex-encefalitis wordt vermoed, wordt soms een hersenbiopsie verricht, omdat het virus met de conventionele methoden niet in de liquor cerebrospinalis kan worden aangetoond. Thans wordt onderzocht of de PCR in deze situatie uitkomst kan bieden. Een aanwijzing hiervoor is de bevinding van Boerman et al. dat de PCR veel beter voldoet dan routine-kweekmethoden bij de bepaling van herpes simplex-virus type 1 in liquor cerebrospinalis van experimenteel geïnfecteerde muizen.11

Bij infectie met parvovirus B19 komen de klinische symptomen vaak pas tot uiting als de viremische periode voorbij is. De routine-diagnostiek is gebaseerd op het meten van de concentratie B19-specifiek IgM. Het aantonen van het virus-DNA is bij deze infectie een snellere methode. Salimans et al. vonden in hun onderzoek naar de snelle bepaling van parvovirus B19 dat de PCR een gevoeligheid heeft die hen in staat stelde 10-50 viruspartikels op te sporen, terwijl voor de bepaling met behulp van de klassieke DNA-filterhybridisatietechniek minimaal 10.000 viruspartikels nodig waren.14

Theoretisch kan de sensitiviteit van de PCR ertoe leiden dat ook latent aanwezige virussen een positief testresultaat opleveren. In de praktijk is gebleken dat dit voor CMV in bloedmonsters bij beperking van het aantal amplificatie-cycli tot 32 niet gebeurt. Voor een goede interpretatie van de PCR-uitslag is het belangrijk om deze te kunnen vergelijken met uitslagen van kweken en serologisch onderzoek.

In principe kunnen voor elk virus waarvan de sequentie bekend is, specifieke primers voor een conservatief deel van het genoom worden gemaakt om de PCR uit te voeren. Bij virussen die veel stamvariaties vertonen, is het aan te bevelen om meer dan één set primers te gebruiken. Van RNA-virussen moet eerst een kopie-DNA met behulp van reverse transcriptase gemaakt worden, waarna deze virussen in principe ook met de PCR aantoonbaar zijn.

Experimentele toepassingen van de PCR in de virologische diagnostiek betreffen onder meer de bepaling van humaan immunodeficiëntievirus type 1 en 2,1314 humaan T-cel-leukemievirus (HTLV) type 1,15 humaan papillomavirus16 en sinds kort ook van Epstein-Barr-virus. De PCR zal in de komende jaren naar alle waarschijnlijkheid een belangrijke plaats bij de virologische diagnostiek gaan innemen en een nuttige aanvulling op de bestaande methoden vormen.

ANDERE TOEPASSINGEN

Veel DNA-onderzoek werd tot voor kort bemoeilijkt, doordat men slechts geringe hoeveelheden intact DNA kon isoleren. Door in vitro-amplificatie van een bepaalde DNA-sequentie met behulp van de PCR kan men echter op eenvoudige wijze voldoende materiaal voor nader onderzoek verkrijgen. Bos et al. amplificeerden op deze manier met succes de DNA-sequentie van het ras-oncogen uit geïsoleerd DNA van dikke-darmtumoren. Hierin konden in een aantal gevallen puntmutaties, die tot activatie van het ras-oncogen hadden geleid, met behulp van DNA-hybridisatietechnieken worden aangetoond.8

Verschillende mutaties bij ?-thalassemie zijn gekarakteriseerd door directe sequentie-analyse van het, met de PCR geamplificeerde, ?-globine-gen.17 Bij de prenatale diagnostiek van erfelijke aandoeningen, zoals sikkelcelanemie en hemofilie A, wordt de PCR toegepast om snel voldoende materiaal voor nader onderzoek te verkrijgen.1819 Onlangs is gepubliceerd dat het zelfs mogelijk is om na in vitro-fertilisatie, vóór de implantatie, van het menselijke embryo het geslacht te bepalen door met de PCR één enkele cel te analyseren. Op deze wijze kon bij mannelijke embryo's een Y-specifieke sequentie geamplificeerd worden.20

Bij chronische myeloïde leukemie zijn door de Philadelphia-translocatie, t(9;22), de BCR- en ABL-genen gefuseerd, hetgeen resulteert in leukemie-specifieke BCR-ABL-messenger-RNA's. Bij patiënten met leukemie die een beenmergtransplantatie hebben ondergaan, is het zeer belangrijk om terugkeer van deze leukemie-specifieke messenger-RNA's zo snel en gevoelig mogelijk op te sporen. Daartoe wordt met behulp van het enzym reverse transcriptase een kopie-DNA (cDNA) van het mRNA uit bloed- of beenmergcellen van een patiënt gemaakt. Met de PCR en geschikte primers kunnen nu de, eventueel aanwezige, diagnostische BCR-ABL-cDNA-sequenties geamplificeerd worden.21

In de forensische geneeskunde zal de PCR van nut kunnen zijn, daar het DNA van een enkele haar of spermacel al voldoende is om de herkomst van het materiaal te bepalen.

Na het commercieel beschikbaar komen van het thermostabiele Taq-DNA-polymerase heeft de polymerasekettingreactie in vele moleculair-biologische onderzoekslaboratoria snel invoering gevonden. Uit deze onderzoekingen zullen waarschijnlijk diverse klinisch-diagnostische toepassingen voortkomen. De discussie over de ethische aspecten van een aantal van de toepassingen valt buiten het bestek van dit artikel. De in dit artikel genoemde voorbeelden geven de diversiteit aan toepassingsmogelijkheden van de PCR weer en zijn niet bedoeld als een compleet overzicht.

Literatuur

  1. Geraedts JPM. Materialen van de moleculaire genetica.Ned Tijdschr Geneeskd 1987; 131:2120-3.

  2. Geraedts JPM. Methoden voor de moleculaire genetica.Ned Tijdschr Geneeskd 1987; 131:2123-8.

  3. Bosman FT. Nieuwe methoden in de pathologische anatomie.Ned Tijdschr Geneeskd 1989; 133:606-13.

  4. Rodenburg CJ, Cornelisse CJ, Fleuren GJ. De betekenis vanDNA-flow-cytometrie bij solide tumoren.Ned Tijdschr Geneeskd 1989; 133:814-8.

  5. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymaticamplification of β-globin genomic sequences and restriction siteanalysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985; 230:1350-4.

  6. Chien A, Edgar DB, Trela JM. Deoxyribonucleic acidpolymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 1976;127: 1550-7.

  7. Saiki RK, Gelfland DH, Stoffel S, et al. Primer-directedenzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science1988; 230: 487-91.

  8. Bos JL, Fearon ER, Hamilton SR, et al. Prevalence of rasgene mutations in human colorectal cancers. Nature 1987; 327:293-7.

  9. Schochetman G, Ou CY, Jones WK. Polymerase chain reaction.J Infect Dis 1988; 158: 1154-7.

  10. Jiwa NM, Gemert GW van, Raap AK, et al. Rapid detectionof human cytomegalovirus DNA in peripheral blood leucocytes of viraemictransplant recipients by the polymerase chain reaction. Transplantation 1989(ter perse).

  11. Boerman RH, Arnoldus EPJ, Raap AK, et al. Polymerasechain reaction and viral culture techniques to detect HSV in small volumes ofcerebrospinal fluid. An experimental mouse encephalitis study. J Virol Meth1989 (ter perse).

  12. Salimans MMM, Holsappel S, Rijke FM van de, Jiwa NM, RaapAK, Weiland HT. Rapid detection of human parvovirus B19 DNA bydot-hybridization and the polymerase chain reaction. J Virol Methods 1989;23: 19-28.

  13. Ou CY, Kwok S, Mitchell SW, et al. DNA amplification fordirect detection of HIV-1 in DNA of peripheral blood mononuclear cells.Science 1988; 239: 295-7.

  14. Rayfield M, DeCock K, Heyward W, et al. Mixed humanimmunodeficiency virus (HIV) infection of an individual: demonstration ofboth HIV type 1 and type 2 proviral sequences by using the polymerase chainreaction. J Infect Dis 1988; 158: 1170-6.

  15. Bhagavati S, Ehrlich G, Kula RW, et al. Detection ofhuman T-cell lymphomaleukemia virus type 1 DNA and antigen in spinalfluid and blood of patients with chronic progressive myelopathy. N Engl J Med1988; 318: 1141-7.

  16. Shibata DK, Arnheim N, Martin WJ. Detection of humanpapilloma virus in paraffin-embedded tissue using the polymerase chainreaction. J Exp Med 1988; 167: 2225-30.

  17. Wong C, Dowling CE, Saiki RK, Higuchi RG, Erlich HA,Kazazian Jr HH. Characterization of β-thalassaemia mutations usingdirect genomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature 1987; 330:384-6.

  18. Embury SH, Scharf SJ, Saiki RK, et al. Rapid prenataldiagnosis of sickle cell anemia by a new method of DNA analysis. N Engl J Med1987; 316: 656-61.

  19. Kogan SC, Doherty M, Gitschier J. An improved method forprenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNAsequences. Application to Hemophilia A. N Engl J Med 1987; 317:985-90.

  20. Handyside AH, Penketh RJA, Winston RML, Pattinson JK,Delhanty JDA, Tuddenham EGD. Biopsy of human preimplantation embryos andsexing by DNA amplification. Lancet 1989; i: 347-9.

  21. Kawasaki ES, Clark SS, Coyne MY, et al. Diagnosis ofchronic myeloid and acute lymphocytic leukemias by detection ofleukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro. Proc Natl Acad Sci USA1988; 85: 5698-702.