Pseudotrombocytopenie door trombocytagglutinaten (EDTA-pseudotrombocytopenie)
Open

Onderzoek
16-09-1986
J. Jacobs, G. Tricot en R.L. Verwilghen

In de periode van één jaar werd bij twaalf patiënten pseudotrombocytopenie vastgesteld: de foutief-lage bloedplaatjestellingen langs geautomatiseerde weg waren te wijten aan bloedplaatjesagglutinatie in aanwezigheid van ethyleendiamine-tetra-acetaat als anticoagulans. Bij geen van de patiënten werden tekenen van een verhoogde bloedingsneiging waargenomen. Indien uitgevoerd, waren de stollingstests normaal en werden er geen trombocytantistoffen gevonden; bij beenmergonderzoeken werd een normale megakaryopoëse aangetoond. Microscopisch onderzoek van het bloeduitstrijkje bracht talrijke trombocytenagglutinaten aan het licht, de bron van deze agglutinaten veroorzaakte een foutief-hoge leukocytentelling langs geautomatiseerde weg.

Het diagnostische en therapeutische belang van pseudotrombocytopenie wordt beklemtoond. Ook andere oorzaken van pseudotrombocytopenie worden vermeld.

Het belangrijkste element bij het herkennen van dit in vitro-artefact blijft het microscopische onderzoek van het perifere bloed. Met heparine onstolbaar gemaakt bloed zal normale trombocytentellingen weergeven. Met fluoride-oxalaat en ook met Na3-citraat ontstold bloed kan eveneens een beeld van pseudotrombocytopenie geven. Het histogram, waarmee moderne automatische partikeltellers uitgerust zijn, vormt een snel en elegant hulpmiddel: bloedplaatjesagglutinaten voegen een karakteristieke curve toe aan het lage-volumina-gebied van het leukocytenhistogram.

Bij het doorgeven en interpreteren van lage bloedplaatjestellingen zou men deze gegevens voor ogen dienen te houden.

Inleiding

INLEIDING

Bloedplaatjestellingen zijn alleen betrouwbaar als talrijke potentiële technische fouten geëlimineerd zijn. De nieuwe generatie elektronische trombocytentellers heeft bewezen accuraat te zijn binnen bepaalde grenzen.1 Ook de reproduceerbaarheid is hoog: Dacie et al. vermeldden reeds tien jaar geleden een variatiecoëfficiënt van slechts 3 tot 4, tegenover 8 tot 10 bij de optische telling.2

Meestal wordt als antistollingsmiddel van het bloed ethyleen-diamine-tetra-acetaat (EDTA) gebruikt, in normale omstandigheden de krachtigste inhibitor van de trombocytaggregatie en -adhesie. Bovendien brengt het slechts een minimum aan morfologische veranderingen teweeg aan de cel.3 Nochtans zijn er foutief-lage trombocytentellingen beschreven bij anticoagulantia zoals EDTA, zowel bij normale personen als bij patiënten met allerlei aandoeningen. Een in vitro-agglutinatie van de trombocyten is hiervoor verantwoordelijk. Het herkennen van dergelijke pseudotrombocytopenie is uitermate belangrijk. Foutief-lage bloedplaatjestellingen kunnen leiden tot diagnostische en therapeutische vergissingen.

In 1 jaar tijd werd pseudotrombocytopenie door agglutinaten vastgesteld bij 12 patiënten, van wie twee worden beschreven. Daarbij valt de nadruk op de herkenning van pseudotrombocytopenie.

METHODEN

Bloedplaatjestellingen worden uitgevoerd in bloed ontstold door K2-EDTA met elektronische partikeltellers (Coulter Counter S-plus en S IV-plus, Ortho ELT-800). De naar volumina gedefinieerde elementen van het bloed worden geteld volgens het principe van de flow-cytometrie, en naar grootte gerangschikt met behulp van een oscilloscoop, de ‘Channelyzer’ (Coulter). De grootte van de getelde partikels bepaalt hierbij de grootte der elektrische impulsen, en deze worden naar stijgende intensiteit gerangschikt. Op een X-as wordt de grootte der partikels uitgezet, terwijl op de Y-as het aantal impulsen afgebeeld wordt. Hieruit wordt een histogram afgeleid. Dit wordt van bloedplaatjes, witte en rode bloedcellen getekend. Als voorbeeld beelden wij het leukocytenhistogram af van de Coulter S IV-plus (figuur 1). De leukocyten (die een schrompelingsproces ondergaan) worden reeds vanaf een volume van 35 femtoliter (fl) geteld.

ZIEKTEGESCHIEDENISSEN

Patiënt A is een 38-jarige huisvrouw zonder belangrijke ziekten in de voorgeschiedenis. Zij raadpleegt haar huisarts wegens paresthesieën in de rechter onderarm. Bij elektronische telling wordt een ernstige trombocytopenie vastgesteld (18 x 109l), die door optische telling wordt bevestigd (35 x 109l). De dagen voordien had zij naproxeen, mefenesine en chloormezanon tegen de pijn ingenomen.

Bij opname blijken geen klinische tekenen van bloedingsneiging te bestaan. Oogfundi en stollingsuitslagen zijn normaal. De trombocytopenie wordt door elektronische telling bevestigd (Ortho ELT-800), en tevens wordt een lichte leukocytose vastgesteld (10,3 x 109l). De patiënte krijgt bloedplaatjes uit 2 eenheden bloed toegediend. In het sternumpunctaat wordt een actieve megakaryocytaire reeks waargenomen, hetgeen het vermoeden van idiopathische trombocytopenische purpura (ITP) versterkt. In het uitstrijkje van perifeer bloed worden echter talrijke trombocytagglutinaten gezien.

In een controlebepaling in bloed ontstold met Li-heparine blijkt evenwel dat het aantal trombocyten en het aantal leukocyten normaal zijn, en ook dat de door additie van trombocytagglutinaten verhoogde top vooraan in het leukocytenhistogram thans bij elektronische telling afwezig is (figuur 2). Bij microscopisch onderzoek van uitgestreken perifeer bloed worden geen trombocytagglutinaten meer waargenomen.

Patiënt B is een man van 89 jaar bij wie twee maanden voor opname een bronchuscarcinoom werd ontdekt. Hij wordt thans opgenomen wegens een ingeklemde liesbreuk. Bij preoperatief laboratoriumonderzoek wordt een ernstige trombopenie vastgesteld (10 x 109l). Omdat men een idiopathische trombocytopenische purpura vermoedt, dient men hem 100 mg prednisolon toe en tevens een bloedplaatjestransfusie uit 6 eenheden bloed. De hemostase tijdens de operatie is normaal. Na de operatie worden sterk schommelende trombocytenwaarden gevonden (van 25 x 109 tot 143 x 109l). De optische bloedplaatjestelling bedraagt 10 x 109l. De stollingsstatus is normaal.

Behalve diazepam, amoxicilline, theofylline en acetylcysteïne neemt de patiënt ook kinidinebisulfaatdurettes: men vermoedt een immuungemedieerde trombopenie hierop, en staakt de toediening van kinidine. Bij een beenmergonderzoek worden weinig celrijke preparaten aangetroffen met een vrij zwak vertegenwoordigde megakaryocytaire reeks. Weerom worden in het uitstrijkje van perifeer bloed trombocytagglutinaten waargenomen. Een pseudotrombocytopenie vermoedend, voeren wij seriële bepalingen uit in K2-EDTA-bloed. Vrij snel wordt er een daling van het aantal trombocyten waargenomen (figuur 3). Tegelijkertijd verschijnt er een ‘additiebeeld’ van trombocytagglutinaten vooraan op het leukocytenhistogram: deze agglutinaten worden, zodra ze volumineus genoeg zijn, als leukocyten geteld en geven aldus aanleiding tot foutief-hoge leukocytentellingen.

Gedurende de volgende maanden stelden wij nog verscheidene gevallen van pseudotrombocytopenie vast. Alle patiënten zijn te zamen ondergebracht in de tabel. Retrospectief achterhaalden wij in dezelfde periode (augustus 1984-juli 1985) nog drie gevallen waarbij de trombocytopenie door dit in vitro-artefact verklaard kan worden.

BESCHOUWING

Vier typen van pseudotrombocytopenie worden onderscheiden: reuzebloedplaatjes, bloedplaatjesagglutinaten, het zg. platelet-satellitisme en trombocytaggregaten.4

– Echte aggregaten berusten op een afnamefout: trombine kan vrijkomen door een zeer traumatiserende venepunctie. Meestal zal deze fout ook eenmalig zijn en bij controle-afname niet gereproduceerd worden.

– Grote bloedplaatjes kunnen een probleem vormen, zowel bij visuele tellingen als bij elektronische tellingen. Bij de eerste methode is het onderscheid met de witte bloedcellen moeilijk. Bij de elektronische telling overschrijden de reuzenbloedplaatjes de voor trombocyten gedefinieerde groottedrempel. Gedurende de vermelde periode van één jaar namen wij drie zulke gevallen waar. Myelodysplasie, de ziekte van May-Hegglin en het syndroom van Alport zijn de afwijkingen waarmee de patiënten zich aandienden.

– Bloedplaatjesagglutinatie en satellitisme houden verband met het anticoagulans: meestal betreft het EDTA. Bij satellitisme gaan de bloedplaatjes zich selectief rondom de neutrofiele segmentkernige cellen groeperen (‘granulocyte-platelet rosettes’).4 Het fenomeen is EDTA-afhankelijk,5 tijdafhankelijk,6 en blijkt geen fixatie-artefact te zijn.7 Het komt voor bij talrijke klinische toestanden, waarin Payne de ‘stress’-factor als gemeenschappelijke noemer meent te onderkennen: het zou gaan om zgn. stress-platelets, jonge bloedplaatjes zoals deze in de circulatie vrijgelaten worden bij gestegen produktie na trombocytopenie.8 Hirokazu Imai et al. spreken over dit fenomeen als pseudotrombocytopenie type II.9 De eigenlijke agglutinaten vertegenwoordigen dan type I.

– Trombocytagglutinaten. De absolute frequentie van dit fenomeen is laag: op een totaal van bijna 60.000 trombocytentellingen in 1 jaar tijds onderkenden wij dit twaalf maal. Gedurende dezelfde periode werden de beenmergpreparaten van 24 patiënten onderzocht, bij wie de trombocytopenie (< 100 x 109l) niet door een gedaalde aanmaak verklaard kon worden (carentie, kwaadaardige aandoeningen). De relatieve frequentie van pseudotrombocytopenie ligt dus hoger. Bovendien lijkt het ons dat pseudotrombocytopenie vaak miskend wordt.

Pseudotrombocytopenie door agglutinaten is zowel bij gezonde als bij zieke individuen beschreven, en dit bij een grote variëteit van aandoeningen. Bij de laatsten gaat het om maligne aandoeningen,35 acute en chronische leverziekten,10 auto-immuunziekten,510 en zeldzame aandoeningen zoals IgA-nefritis.9 Tussen deze uiteenlopende klinische toestanden zien de meeste schrijvers geen verband. Veenhoven et al. onderkennen algemene ziektebeelden met verhoogde (IgM-)globulinefractie als gemeenschappelijke factor.11 Gowland et al. beschrijven de bloedplaatjes als bleker dan normaal.3 Het aantal azurofiele korrels zou verminderd zijn.

De meeste auteurs concluderen dat EDTA de verantwoordelijke cofactor is, in aanwezigheid van koude agglutininen van het IgM-type,410 of van een temperatuuronafhankelijk IgG-globuline.12 Watkins et al. vermelden een niet gespecificeerd ?-globuline.13 Onder en medewerkers beschrijven twee typen agglutininen: een type I, een divalent IgG en een type II, een IgM dat reageert zo de calciumconcentratie kleiner wordt dan 50 µmol.10 Belangrijk is dat bij dit laatste type er ook agglutinaten optreden bij ontstolling van bloed met Na3-citraat en fluoride-oxalaat, een fenomeen dat bij enkele van onze patiënten ook waargenomen werd. Pegels et al. toonden IgG-, IgA- en IgM-antistoffen aan.14

De rol van EDTA is fel bediscussieerd en loopt over twee sporen.310 (1) Calcium vormt een element van biologische membranen; het is geïncorporeerd in membraanproteïnen (de carboxylgroep van glutamaat en aspartaat) en in de fosfolipiden (fosfaatgroepen). Door de chelatie in EDTA wordt het calciumion onttrokken aan de membraan, die daardoor wordt gemodificeerd. Wellicht zou aldus een nieuwe antigene determinant bepaald worden, waarmee een IgM-immunoglobuline zou interageren. Hiermee zou ook het optreden van trombocytagglutinatie bij citraat en oxalaat verklaard kunnen worden. Bij heparine komt dit niet voor: heparine neutraliseert trombine, en weerhoudt calcium niet, zoals de andere anticoagulantia doen. (2) EDTA zou rechtstreeks de membraan beschadigen, bijv. door reactie met de positieve NH3-groepen uit lysine. Het is bekend dat rode bloedcellen en trombocyten langer overleven op acid citrate dextrose (ACD) dan op EDTA. Dit directe toxische effect van EDTA op de membraan zou evenzo een neo-antigeen kunnen induceren, waarmee een globulinemolecule kan reageren. Ter preventie van de EDTA-afhankelijke agglutinatie vermelden Berning et al. dat men de pH van het bloedstaal moet terugbrengen tot 5,5. Agglutinatie treedt dan niet op.15

Het grote belang van juiste bloedplaatjestellingen maakt het snel herkennen van dit in vitro-artefact noodzakelijk. Het ontbreken van verhoogde bloedingsneiging bij ernstige trombocytopenie en de sterk uiteenlopende waarden bij controlebloednamen (ook bij optische tellingen!) moeten een vermoeden doen rijzen. Door microscopisch onderzoek van het perifere-bloeduitstrijkje zullen talrijke agglutinaten worden aangetoond. Deze kunnen zich zowel in de uitlopers van de uitstrijk als centraal bevinden: het verdient aanbeveling verscheidene velden te overschouwen. Controlestalen met Na3-citraat, fluoride-oxalaat, doch vooral met Li-heparine bevestigen het artificiële karakter van de trombocytopenie. Een snel en illustratief hulpmiddel is het histogram, dat door de moderne elektronische partikeltellers afgebeeld wordt, waarbij de trombocytagglutinaten zich ophopen vooraan in het leukocytenhistogram. Ze worden als leukocyten geteld en geven aldus aanleiding tot foutief-hoge leukocytentellingen, zoals in de figuren 2 en 3 weergegeven wordt.

Zo het histogram niet aan bepaalde mathematische criteria voldoet, wordt het ‘flagged’: een symbool (R1) duidt de regio van interferentie aan (Coulter S IV-plus). Een dergelijk beeld is sterk suggestief voor trombocytagglutinaten, doch het dient gedifferentieerd te worden met andere interferenties. Normoblasten, niet-gelyseerde rode bloedcellen, proteïnemie en cryoglobulinen zijn er de voornaamste van, naast de vermelde reuzentrombocyten. Desalniettemin is dit beeld op het histogram een snel en duidelijk hulpmiddel, dat het definitief herkennen van de agglutinaten bij microscopisch onderzoek kan voorafgaan.

Literatuur

  1. Mayer K, Chin B, Magnes J, Thaler HT, Lotspeich C, BaisleyA. Automated platelet counters: a comparative evaluation of latestinstrumentation. Am J Clin Pathol 1980; 74: 135-50.

  2. Dacie JV, Lewis SM. Practical haematology. 5th ed.Edinburgh: Churchill Livingstone, 1975: 57.

  3. Gowland E, Kay HEM, Spillman JC, Williamson JR.Agglutination of platelets by a serum factor in the presence of EDTA. J ClinPathol 1969; 22: 460-4.

  4. Kjeldsberg C. Platelet satellitism. N Engl J Med 1974;290: 165.

  5. Kjeldsberg CR, Hershgold EJ. Spurious thrombocytopenia.JAMA 1974; 227: 628-30.

  6. Skinnider LF, Musclow CE, Kahn W. Platelet satellitism. Anultrastructural study. Am J Hematol 1978; 4: 179-85.

  7. Kjeldsberg CR, Swanson J. Platelet satellitism. Blood1973; 43: 831-6.

  8. Payne CM. Platelet satellitism: an ultrastructural study.Am J Pathol 1981; 103 (1): 116-28.

  9. Imai H, Nakamoto Y, Miki K, et al. Pseudothrombocytopeniaand IgA-related platelet agglutinin in a patient with IgA nephritis. Nephron1983; 34: 154-8.

  10. Onder V, Weinstein A, Hoyer LW. Pseudothrombocytopeniacaused by platelet agglutinins that are reactive in blood anticoagulated withchelating agents. Blood 1980; 56: 177-82.

  11. Veenhoven WA, Schans GS van der, Huiges W, et al.Pseudothrombocytopenia due to agglutinins. Am J Clin Pathol 1979; 72:1005-8.

  12. Schreiner DR, Bell WR. Pseudothrombocytopenia:Manifestation of a new type of platelet agglutinin. Blood 1973; 42:541-9.

  13. Watkins SP, Shulman RN. Platelet cold agglutinins. Blood1970; 36: 153-8.

  14. Pegels JG, Bruynes EC, Engelfriet CP, Borne AEGKr vondem. Pseudothrombocytopenia: an immunologic study on platelet antibodiesdependent on ethylene diamine tetra-acetate. Blood 1982; 59:157-61.

  15. Berning H, Stilbo I. Pseudothrombocytopenia and thehaematology laboratory (letter). Lancet 1982; ii:1469-70.