Nobelprijs Geneeskunde 1993 voor de ontdekking van gespleten genen
Open

Commentaar
30-12-1993
H.F. Tabak

De Nobelprijs voor Geneeskunde is dit jaar toegekend aan Phillip Sharp en Richard Roberts voor de ontdekking van gespleten genen. Beide wetenschappers leidden in de jaren zeventig onderzoeksgroepen die zich bezighielden met de bestudering van genexpressie bij adenovirussen. Door het relatief geringe aantal genen dat in het adenovirus-DNA is geprogrammeerd, is dit virus een geliefd modelsysteem om complexe biologische processen te bestuderen. Onder andere uit het adenovirusDNA-replicatiewerk van de Utrechtse groep geleid door P.van der Vliet en het onderzoek naar oncogene transformatie door adenovirus dat door Van der Eb wordt verricht in Leiden blijkt dat het adenovirus zich nog steeds in een warme belangstelling mag verheugen.

Bij het onderzoek van Sharp en Roberts stond het proces van genexpressie centraal. Genetische informatie is geprogrammeerd in DNA en mobilisatie van deze informatie (gen) komt tot stand door een RNA-kopie (mRNA) te maken (transcriptie) dat voor een eiwit codeert. Dit mRNA wordt in bacteriën met behulp van ribosomen en ‘transfer’-RNA's in eiwit vertaald (translatie). In figuur 1a zijn deze processen schematisch weergegeven.

In hogere eukaryoten had het onderzoek naar transcriptie echter een aantal moeilijk te verklaren waarnemingen opgeleverd. In de kern worden zeer lange RNA-ketens gesynthetiseerd, maar verreweg de meeste hiervan bereiken nimmer het cytoplasma, waar de eiwitsynthese plaatsvindt en waar het mRNA voor vertaling dient te arriveren. Aangezien destijds de technieken nog niet beschikbaar waren om in het ingewikkelde DNA van hogere eukaryoten naar transcriptie van individuele genen te kijken, was het onderzoek naar deze opmerkelijke waarnemingen in een impasse geraakt. Het adenovirusmodel leende zich veel beter voor nadere bestudering van deze verschijnselen en in 1977 rapporteerden Sharp en Roberts gelijktijdig tijdens het ‘Cold Spring Harbor Symposium on chromatin’ hun baanbrekende resultaten ten aanzien van de genstructuur bij adenovirus, later volgden publikaties hierover.12 Door anderen werd vervolgens snel bevestigd dat het hier ging om een principe dat kenmerkend is voor de genstructuur van eukaryoten in het algemeen.

Tegen welke achtergrond moeten wij het innoverende karakter van de waarnemingen van Sharp en Roberts plaatsen?

Gespleten genstructuur.

De basisconcepten voor expressie van genen zijn verkregen uit onderzoek met bacteriën en bacteriofagen. Een van de gulden regels die in deze beginjaren door Yanofsky werden opgesteld, luidde dat de aminozuurvolgorde in een eiwit colineair is met de nucleotiden(triplet)volgorde in het corresponderende mRNA, dat op zijn beurt weer colineair is met het DNA waarvan het mRNA is gekopieerd in het transcriptieproces. Dit laatste is inderdaad regel bij prokaryoten, maar blijkt uitzondering te zijn bij eukaryoten. Hier komt het mRNA op een veel ingewikkelder wijze tot stand (zie figuur 1b). Bij een van de meest aansprekende experimenten die Sharp en Roberts uitvoerden om dit te illustreren maakten zij gebruik van een elektronenmicroscoop om de adenovirus-DNA en -RNA-moleculen en hun interacties direct zichtbaar te maken. Een schematische weergave hiervan is in figuur 2 beschreven. Een van de genen op het adenovirus-DNA codeert voor het virale manteleiwit. Het adenovirus-DNA kan met behulp van restrictie-endonucleasen in afzonderlijke fragmenten geknipt worden, waarna het mRNA voor het manteleiwit met deze DNA-fragmenten geïncubeerd kan worden onder condities waarbij een DNA-RNAhybride stabieler is dan DNA in duplexvorm. Daar waar het mRNA overeenkomt in nucleotidenvolgorde verdringt het een DNA-streng en ‘basepaart’ het met de complementaire DNA-streng. De uitkomst van het experiment toont aan dat het mRNA niet over de hele lengte colineair is met het adenovirus-DNA. Het voorste deel van het mRNA blijkt afkomstig te zijn van een meer naar voren gelegen stuk adenovirus-DNA. De genetische informatie in het adenovirus-DNA die gebruikt wordt om het mRNA te specificeren komt dus niet aaneensluitend, maar in afzonderlijke, los van elkaar gelegen stukken voor; met andere woorden: het gen voor het manteleiwit is gespleten.

Bij beide onderzoeksgroepen is de experimentele onderbouwing voor het bestaan van de gespleten genstructuur in belangrijke mate gebaseerd op het zichtbaar maken van de macromoleculen met behulp van elektronenmicroscopie. Het is dan ook jammer dat de cruciale bijdrage van deze kant zo weinig erkenning heeft gekregen en dat, zoals vaker is voorgekomen, de elektronenmicroscopisten niet in de prijzen meedelen.

De DNA-stukken waarvan de RNA-kopieën het cytoplasma bereiken, worden exons genoemd, de tussenliggende stukken introns. De puzzelstukken waarmee andere groepen zaten, vielen nu ook snel op hun plaats en kort daarop konden Leder, Flavell en Chambon rapporteren dat de genen die coderen voor ?-globine en ovalbumine ook versnipperd in exons en introns in het genoom van de muis en de mens voorkomen. Met de technieken die Jeffreys en Flavell hiervoor gebruikt hebben, zijn zij tevens in staat geweest om als een der eerste groepen afwijkingen in genen aan te tonen en hebben zij de ontwikkeling van DNA-diagnostiek in Nederland een vliegende start gegeven.

De bizarre waarneming dat het meeste RNA de kern niet verlaat, werd nu ook verklaarbaar. Een gespleten gen wordt met exons en introns en al in een voorloperRNA gekopieerd. Op RNA-niveau worden nu de exons losgeknipt en met elkaar verbonden in een proces dat RNA-‘splicing’ wordt genoemd (zie figuur 1b). De geëlimineerde introns, die soms een respectabele lengte kunnen hebben, worden in de kern afgebroken, terwijl de resterende exons als mRNA de kern verlaten. Het gen voor het ?-globine-eiwit is relatief eenvoudig met 2 kleine introns en 3 exons. De meeste andere genen hebben echter veel grotere afmetingen. Het gen voor collageen strekt zich uit over 38.000 baseparen (bp) en bevat meer dan 50 introns. Na RNA-splicing blijft minder dan 15 van het oorspronkelijke voorloper-RNA over (figuur 3). Tot nu toe spant het gen voor dystrofine in dit opzicht wel de kroon en het is dan ook begrijpelijk dat het gen een gemakkelijk doelwit kan zijn voor mutaties, leidend tot musculaire dystrofie van Duchenne. Het gen dat 65 exons met een gemiddelde omvang van 200 bp omvat, ligt uitgespreid over een afstand van circa 2,5 x 106 bp. De gemiddelde intronlengte van 35.000 nucleotiden is veel groter dan de gemiddelde exonlengte en het grootste intron heeft zelfs een lengte van 250.000 nucleotiden. Meer dan 150 eenheden van het gespleten ?-globine-gen zouden met gemak alleen al in dit intron passen.

IMPLICATIES

De ontdekking van de gespleten genstructuur heeft verstrekkende consequenties gehad voor verdere verdieping van inzicht in andere processen en voor de verklaring van de moleculaire basis van diverse ziekten. Als goede voorbeelden hiervan kunnen genoemd worden: alternatieve splicing en de hemoglobinopathieën.3 De gespleten genstructuur laat voor sommige andere eiwitten een beperkte variabiliteit toe door exonkeuze. Het gen voor het spiereiwit tropomyosine bevat 14 exons. Deze worden in verschillende combinaties vanuit een voorloper-RNA in een mRNA gebouwd door alternatieve splicing. Zo ontstaan verschillende tropomyosineeiwitten, waarvan de structuur toegesneden is op het functioneren in verschillende celtypen (skeletspier, gladde spier en niet-spiercellen).

Vooral Sharp heeft ook een belangrijke rol gespeeld in het onderzoek naar het mechanisme van RNAsplicing. Diverse componenten zoals RNA-eiwitcomplexen (ribonucleo-proteïnepartikels) nemen aan het splicing-proces deel. De RNA's van deze partikels kunnen door baseparing de splice-punten in het voorloperRNA herkennen, waarna de eiwitten geacht worden het vereiste knip- en plakwerk te verrichten voor het maken van het mRNA. Immers, alle katalytische gebeurtenissen in de cel worden door enzymen verzorgd. Ook dit dogma is nu gesneuveld door het onderzoek van Cech aan de hand van een gespleten gen dat voorkomt in Tetrahymena. Hier blijkt het RNA-intron zijn eigen excisie uit het precursor-RNA te kunnen katalyseren door RNA-‘self-splicing’. Inmiddels is duidelijk geworden dat RNA-katalyse een weliswaar bijzonder, maar toch vaker in de natuur voorkomend verschijnsel is. De Nobelprijs voor dit werk, al eerder verleend aan Cech, gaat dus terug naar de basis die voor deze ontdekking is gelegd door het werk van Roberts en Sharp.

Een intrigerende vraag die niet zo makkelijk is te beantwoorden is hoe deze gespleten genstructuur kon ontstaan in de evolutie en welk doel ermee is gediend. De interessantste gedachten hierover zijn naar voren gebracht door Gilbert. De eerste eiwitten of peptiden zullen kort en eenvoudig geweest zijn. Verbetering van functie van zulke eiwitten kan op twee manieren voorgesteld worden:

– het langdurig sleutelen door veranderingen die optreden via mutaties in het gen voor een bestaand eiwit leidt tot een graduele toename van complexiteit en een verbetering van functie, of

– het arrangeren van bestaande genen in nieuwe combinaties kan leiden tot een spectaculaire, sprongsgewijze toename in verbetering van eiwitkwaliteit en in de overlevingskansen van een organisme met zo'n nieuw gen.

In veel eiwitten valt zo'n multidomeinstructuur te onderkennen en markant is dat deze domeinen vaak overeenkomen met de afzonderlijke exons waaruit het gen voor zo'n modern eiwit is samengesteld. Deze laatste waarneming en de snellere aanpassingssnelheid van eiwitten aan een veranderende omgeving door zogenaamde ‘exon shuffling’ vormen de beste argumenten die Gilberts voorstellen ondersteunen.

Het principe van de gespleten genstructuur en RNAsplicing is kennelijk een succesformule die de natuur op gevarieerde wijze telkens opnieuw toepast, getuige recente publikaties. Hierin wordt melding gemaakt van voorlopereiwitten waaruit een middengedeelte (eiwitintron) geknipt wordt, waarna de uiteinden (eiwitexons) met een nieuwe peptidebinding weer onderling verbonden worden. Hier is het eiwit-intron de drijvende kracht die het proces uitvoert en de analogie met RNAself-splicing is opvallend.

Uit deze terugblik in vogelvlucht over de 15 jaren die verstreken zijn na de ontdekking van gespleten genen is duidelijk dat het werk van Sharp en Roberts de basis heeft gelegd voor een enorme toename in onze kennis omtrent genexpressie en de verrassende wijzen waarop de natuur op gevarieerde manier met beschikbare genetische informatie weet om te springen. Deze nieuwe vondsten zijn niet alleen van academisch belang, maar verschaffen ook inzicht in het ontstaan van sommige ziekten. Een wel zeer typerend voorbeeld is te vinden in een mutatie in het ?-globine-gen die leidt tot thalassemie. De verantwoordelijke mutatie ligt in het eerste exon en verandert het derde nucleotide van een triplet dat codeert voor glycine. Door de overtolligheid in de genetische code blijft het mRNA echter voor glycine coderen, zodat moeilijk te begrijpen valt wat er mis gaat op basis van het klassieke en inmiddels achterhaalde genexpressiemodel. Met de kennis van gespleten genen wordt opeens begrijpelijk wat hier voor bijzonders aan de hand is. De mutatie leidt namelijk tot foutieve splicing (figuur 4) en een deel van het exon wordt samen met het intron weggesneden. Het gevolg is dat in het mRNA een deel van het leesraam ontbreekt en dat als gevolg daarvan een drastisch veranderd (ingekort) ?– globine-eiwit wordt gemaakt.

Dit voorbeeld is er slechts één van een groeiende lijst die aangeeft hoe een complexe manier van genexpressie zijn tol eist als extra bron van potentiële fouten door genetische afwijkingen in ons genoom. Het illustreert tevens hoe belangrijk het nog steeds is om onze fundamentele kennis verder te verdiepen om beter inzicht te krijgen in de moleculaire basis van de ontsporingen die leiden tot ziekten.

Ik dank prof.dr.P.Borst, Amsterdam, voor zijn kritisch commentaar op dit artikel.

Literatuur

  1. Chow LT, Gelinas RE, Broker TR, Roberts R. An amazingsequence arrangement at the 5‘ ends of adenovirus 2 messenger RNA. Cell1977; 12: 1-8.

  2. Berget SM, Moore C. Sharp PA. Spliced segments at the5‘ terminus of adenovirus 2 late mRNA. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74:3171-5.

  3. Borst P. Gespleten genen, hemoglobine en prenatalediagnostiek. Ned Tijdschr Geneeskd1978; 122: 1448-53.