Nederlandse Vereniging voor Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde
Open

Mededelingen
24-11-2004

Vergadering gehouden op 22 en 23 april 2004 te Lunteren

H.M.Dijstelbloem (Amersfoort), 57e congres Nederlandse Vereniging voor Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde

Op 22 en 23 april 2004 vond het 57e jaarlijkse congres van de Nederlandse Vereniging voor Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde (NVKC) plaats te Lunteren. Het wetenschappelijk programma bestond uit een drietal plenaire lezingen. Gastspreker dr.H.Pijl (Leids Universitair Medisch Centrum) bracht de neuro-endocriene aspecten van adipositas voor het voetlicht, prof.dr.M.A.Crawford (London Metropolitan University, Verenigd Koninkrijk) gaf een overzicht van de evolutie van de menselijke hersenen in relatie tot het hedendaagse voedingspatroon, en mw.prof.dr.G.J.Navis (Academisch Ziekenhuis Groningen) besprak de invloed van bloeddruk en andere factoren op zoutgevoeligheid.

Er waren 125 ingezonden abstracts. Deze werden verdeeld over 3 categorieën (analytische onderwerpen, klinische onderwerpen en bedrijfsvoering) en als poster of als mondelinge voordracht gepresenteerd. Ook dit jaar kon worden geconstateerd dat in de klinisch-chemische laboratoria uitstekend onderzoek plaatsvindt op een breed gebied en in intensieve samenwerking met klinische onderzoeksgroepen.

Eenieder die geïnteresseerd is in verdergaande informatie over het wetenschappelijk programma van de bijeenkomst wordt verwezen naar het Nederlands Tijdschrift voor Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde (2004;29:58-102).

De samenvattingen van de naar het oordeel van de Wetenschapscommissie 10 beste presentaties zijn opgenomen in dit verslag.

S.G.Heil, M.den Heijer, L.A.J.Kluijtmans, B.J.M.van der Rijt-Pisa en H.J.Blom (Nijmegen), Interactie tussen het 894-GT-polymorfisme in het endotheliale-stikstofmonoxidesynthase(eNOS)-gen en hyperhomocysteïnemie; verhoogd risico op recidieven van veneuze trombose

Veneuze trombose is een aandoening waarbij zowel genetische als verworven risicofactoren een rol spelen. Hyperhomocysteïnemie is geassocieerd met een 2-voudig verhoogd risico op recidieven van veneuze trombose. Recentelijk is een polymorfisme beschreven in het gen dat verantwoordelijk is voor de productie van stikstofmonoxide (NO) in de endotheelcel (eNOS). Dit 894-G> T-polymorfisme is in verband gebracht met verhoogde homocysteïnespiegels. In deze studie hebben we onderzocht of dit 894-G> T-polymorfisme van invloed is op de relatie tussen hyperhomocysteïnemie en recidieven van veneuze trombose.

Methoden.

Het 894-G> T-polymorfisme in het eNOS-gen werd bepaald bij 170 patiënten met recidieven van veneuze trombose en bij 433 controlepersonen uit de algemene populatie.

Resultaten.

Het eNOS-894-TT-genotype werd relatief vaker gevonden bij patiënten dan bij controlepersonen en is daardoor geassocieerd met een licht verhoogd risico op recidieven van veneuze trombose (oddsratio (OR): 1,3 (0,7-2,6)). Hoewel het 894-G> T-polymorfisme zelf niet geassocieerd was met verhoogde homocysteïnespiegels bij de controlepersonen, hadden patiënten die een verhoogde plasmahomocysteïnespiegel hadden en ook het eNOS-894-TT-genotype bezaten, een sterk verhoogd risico op het ontwikkelen van recidieven van veneuze trombose (OR: 5,3 (1,1-24,1)).

Conclusies.

Deze studie laat zien dat het hebben van het eNOS-894-TT-genotype in combinatie met een verhoogde homocysteïnespiegel leidt tot een sterk verhoogd risico op het ontwikkelen van recidieven van veneuze trombose. NO kan reageren met homocysteïne tot s-nitrosothiolen en voorkomt zo de nadelige effecten van homocysteïne op het tromboserisico. Een mogelijke hypothese voor deze interactie tussen eNOS en hyperhomocysteïnemie is dat, ten gevolge van het 894-G> T-polymorfisme, de biologische beschikbaarheid van NO afneemt, waardoor de nadelige effecten van homocysteïne op het tromboserisico versterkt worden.

M.Kamphuis, E.N.H.Jansen Steur, G.F.Jirikowski, C.Haanen en I.Vermes (Enschede), Verhoogde concentratie ‘tissue’-transglutaminase in de liquor van patiënten met de ziekte van Parkinson; wijzend op apoptose

‘Tissue’-transglutaminase (t.TG) is een transamiderend enzym dat het optreden van kruisverbindingen tussen intracellulaire eiwitten katalyseert en zodoende een eiwitskelet tot stand brengt dat lekkage van intracellulaire bestanddelen voorkomt. Het t.TG wordt geactiveerd tijdens de apoptotische celdoodcascade en speelt een sleutelrol bij de vorming van apoptotische lichaampjes. Apoptotische celdood wordt verondersteld ten grondslag te liggen aan het verlies van dopaminerge nigrostriatale neuronen bij de ziekte van Parkinson (ZP). Deze hypothese is gebaseerd op histochemisch onderzoek van hersenweefsel van ZP-patiënten. Dit werd bij autopsie verkregen op het moment dat geen onderscheid mogelijk is tussen celdood opgetreden tijdens het leven en postmortaal.

Methoden.

Wij beschikten over lumbale liquormonsters van 54 ZP-patiënten en van 34 controlepersonen zonder tekenen van neurodegeneratieve afwijkingen. De diagnose ‘ZP’ werd gesteld op grond van klinische symptomen (tremor, rigiditeit, bradykinesie, houdingsafwijkingen), cognitieve functies en slaapstoornissen. Het t.TG werd in de liquor gemeten met een gevoelige en specifieke ELISA. De gevoeligheid van de test was 0,5 ng/l, de inter- en-intra-assayvariatiecoëfficiënt was < 5.

Resultaten.

Wij vonden in de liquormonsters van de ZP-patiënten significant hogere t.TG-concentraties vergeleken met die in de liquormonsters van de controlepersonen (70,3 ng/l versus 7,6 ng/l; p < 0,001). Er werd geen correlatie gevonden tussen t.TG-concentraties en cognitieve functies, de mate van slaapstoornis en duur van de ziekte.

Conclusies.

Voorzover ons bekend is dit de eerste directe ex-vivowaarneming die wijst op toegenomen neurale apoptotische celdood bij patiënten met ZP. Het t.TG is een redelijk robuust enzym, dat kan dienen als een ideale in-vivoparameter voor apoptose, gerelateerd aan neurodegeneratieve ziekten in een stadium waarop therapie nog mogelijk kan zijn.

G.S.Salomons, P.Darmin, N.M.Verhoeven, D.Marsden, C. Schwartz, G.Mancini, T.J.DeGrauw en C.Jakobs (Amsterdam), Creatine-‘transporter’-deficiëntie: een relatief veelvoorkomende oorzaak van X-gebonden mentale retardatie

Wij hebben een nieuwe aangeboren stofwisselingsziekte ontdekt, welke wordt veroorzaakt door een defect in het creatine-‘transporter’-gen dat gelegen is op Xq28. De kenmerken van deze ziekte zijn: X-gebonden mentale retardatie (XLMR), expressieve spraak- en taalachterstand, epilepsie en autistisch gedrag. Bij ongeveer 50 van de draagsters zijn leerproblemen geconstateerd. Behandeling van de aangedane mannen met creatinesuppletie is tot nog toe niet succesvol gebleken.

Methoden.

Wij hebben 10 niet-verwante families (17 mannelijke patiënten en 10 draagsters) op moleculair en biochemisch niveau onderzocht op creatinetransporterdeficiëntie, waarbij (a) creatinedeficiëntie in de hersenen van de indexpatiënt was gediagnosticeerd door middel van H-magnetischeresonantiespectroscopie (H-MRS) (n = 7) en (b) de stamboom (en koppelingsonderzoek in 1 familie) suggereerde dat het een XLMR-familie betrof (n = 3). Creatine en guanidineacetaat in urine en plasma werden bepaald door middel van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) met stabiele-isotoopdilutie.

Resultaten.

De creatine-creatinineratio in urine bleek verhoogd bij alle geteste mannelijke patiënten. Creatineopname in gekweekte fibroblasten van de aangedane mannen was defect. DNA-sequentieanalyse van de coderende gebieden van het SLC6A8-gen resulteerde in de ontdekking van 1 aminozuurdeletie (n = 3), nonsensemutaties (n = 2), 1 base-insertie (n = 1), een transversie welke resulteerde in een ‘missense’-mutatie en alternatieve ‘splicing’ (n = 1), een ‘splice site’-mutatie (n = 1) en grote genomische deleties (n = 2). 5 families waren afkomstig uit 1 metropoolgebied. Dit suggereert dat SLC6A8-deficiëntie een relatief hoge incidentie heeft.

Conclusies.

Voor de screening van SLC6A8-deficiëntie blijken H-MRS van de hersenen, creatine-creatininemetingen in urine en SLC6A8-DNA-sequentieanalyse alle waardevolle primaire diagnostische tests te zijn, die elkaar kunnen complementeren.

M.M.A.L.Pelsers, J.Bakker, Y.Pinto, M.P.van Dieijen-Visser, W.T.Hermens en J.F.C.Glatz (Maastricht), Plasma-‘heart-type fatty acid-binding protein’ (H-FABP): gevoeliger marker voor hartschade bij chronisch hartfalen dan troponine T

Bij een groot deel van de patiënten met chronisch hartfalen (CHF) is een verhoogde plasmaconcentratie van (cardiaal) troponine T (cTnT) aangetoond. Dit betekent dat progressieve vermindering van de ventriculaire functie bij CHF-patiënten is geassocieerd met geringe continue hartschade. In deze studie hebben we een vergelijking gemaakt tussen ‘heart-type fatty acid-binding protein’ (H-FABP) en cTnT als plasmamarkers voor hartschade bij CHF.

Methoden.

Bloedmonsters werden verkregen bij binnenkomst op de eerste harthulp van 58 opeenvolgende patiënten met CHF (New York Heart Association(NYHA)-klasse III of IV). Alle patiënten hadden een verhoogde plasma-NT-pro-BNP-concentratie (? 62 pmol/l) en geen skeletspierschade (plasmamyoglobine-H-FABP-ratio < 7). De nierfunctie was bij deze patiënten niet verminderd (plasmacreatinine < 120 ?mol/l). H-FABP werd bepaald met behulp van een specifieke immunoassay, en TnT, NT-pro-BNP en myoglobine met behulp van een elektrochemiluminiscentie-immunoassay(ECLIA)-methode (Elecsys; Roche Diagnostics, Almere).

Resultaten.

In de totale CHF-groep was plasma-cTnT verhoogd (> 0,02 ?g/l) bij 31 patiënten; mediaan: 0,083 ?g/l (25-75-percentiel: 0,036-0,269 ?g/l). H-FABP was verhoogd (> 6 ?g/l) bij 47 patiënten; mediaan: 13,3 ?g/l (25-75-percentiel: 9,1-20,7 ?g/l). De patiënten konden onderverdeeld worden in 4 groepen, afhankelijk van de plasmaconcentraties van H-FABP en cTnT. Bij 28 patiënten waren cTnT- en H-FABP-concentraties beide verhoogd, terwijl in 15 patiënten de cTnT- en H-FABP-concentraties normaal waren. Slechts 3 patiënten hadden een normale H-FABP-concentratie en een verhoogde cTnT-concentratie, terwijl 19 patiënten (29) een verhoogde plasma-H-FABP-waarde hadden, ondanks een normale plasma-cTnT-waarde.

Conclusies.

(a) Geringe hartschade is detecteerbaar bij een aanzienlijk aantal patiënten met CHF. (b) H-FABP is een gevoeliger marker voor detectie van geringe hartschade dan cTnT.

I.J.Schultz, L.A.Kiemeney, H.F.M.Karthaus, J.A.Witjes, J.L. Willems, D.W.Swinkels, J.M.T.Klein Gunnewiek en J.B.de Kok (Nijmegen), Samenhang tussen survivine-mRNA-expressie in blaaswassingen en tumorrecidivering bij patiënten met oppervlakkig urotheelcelcarcinoom

De meest voorkomende vorm van blaaskanker is urotheelcelcarcinoom (UCC). Patiënten met een oppervlakkig UCC krijgen na transurethrale resectie van de tumor (TURT) frequent recidieven. Deze patiënten worden daarom regelmatig gecontroleerd met behulp van cystoscopie, de gouden standaard voor het opsporen van recidieven in de blaas. Deze procedure is invasief, arbeidsintensief en duur. Het aantal cystoscopieën zou gereduceerd kunnen worden als de tijd tot recidiefvorming na de TURT beter voorspeld zou kunnen worden. In een eerdere studie lieten wij zien dat mRNA-expressie van het (antiapoptose)gen survivine in blaastumorweefsel indicatief is voor het snel of laat optreden van recidieven bij patiënten met oppervlakkig UCC. In de huidige studie hebben we onderzocht of de mRNA-expressie van survivine in blaaswassingen eenzelfde resultaat geeft. Blaaswassingen geven in tegenstelling tot selectieve biopten een representatief beeld van de gehele blaas tijdens tumorgenese, en het uitvoeren ervan is eenvoudig.

Methoden.

Van 36 patiënten, met UCC van verschillende stadiëring en gradering, werden blaaswassingen (50 ml) verzameld vlak voor de TURT. Na RNA-isolatie uit cellen werd de survivine-mRNA-expressie kwantitatief gemeten met behulp van ‘real-time’-PCR.

Resultaten.

Kaplan-Meier-curven lieten zien dat patiënten met oppervlakkig UCC (n = 26) en een expressie onder de mediane waarde van 0,13 (n = 13) minder snel recidieven kregen dan patiënten met een expressie hoger dan 0,13 (p-waarde = 0,018). De gemiddelde recidieftijd van patiënten boven en onder de mediaan was 22 en 10 maanden, respectievelijk. Er werd geen relatie gevonden met tumorstadium en graad.

Conclusies.

De mate van survivine-mRNA-expressie in blaaswassingen van patiënten met oppervlakkig UCC lijkt snel of laat optreden van recidiefvorming na TURT te kunnen voorspellen.

M.M.A.L.Pelsers, T.Hanhoff, D.van der Voort, J.R.de Kruijk, A.Twijstra, W.Rudzifiski, P.Menheere, W.T.Hermens en J.F.C. Glatz (Maastricht), ‘Brain-type’ en ‘heart-type fatty acid-binding protein’ (B- en H-FABP) als nieuwe plasmamarkers voor het aantonen van hersenschade

Gevoelige biochemische markers zijn belangrijk voor het in een vroeg stadium aantonen van hersenschade. ‘Brain-type’ en ‘heart-type fatty acid-binding protein’ (B-FABP en H-FABP) komen snel vrij uit beschadigde hersencellen. In deze studie hebben we de weefselinhoud en de klinische toepassing geëvalueerd.

Methoden.

De weefselconcentratie van B-FABP en H-FABP is bepaald in segmenten van humaan hersenweefsel (frontaal-, temporaal- en occipitaalkwab, striatum, pons en cerebellum). Voor de evaluatie van de klinische toepassing zijn serumwaarden van B-FABP, H-FABP, S-100B en ‘neuronspecific enolase’ (NSE) bepaald bij 130 patiënten met milde traumatische hersenschade. Alle markers werden bepaald met behulp van specifieke immunoassays (ELISA).

Resultaten.

De weefselconcentratie van H-FABP was > 10 maal hoger dan die van B-FABP. Frontaal-, temporaal- en occipitaalkwab, striatum, pons en cerebellum bevatten respectievelijk 26,3 (SD: 1,8), 31,9 (4,8), 21,2 (3,0), 30,6 (5,1), 39,5 (4,0) en 16,2 (2,2) ?g/g H-FABP . De waarden van B-FABP waren respectievelijk 3,2 (0,19), 2,2 (0,03), 1,01 (0,05), 0,755 (0,03), 2,01 (0,07) en 2,80 (0,18) ?g/g. In de mildtraumastudie waren de S-100B-serumwaarden verhoogd (> 0,3 ?g/l) bij 45,4 van de patiënten, en NSE bij 50,8 (> 10 ?g/l). Echter, B-FABP en H-FABP waren verhoogd bij respectievelijk 66,9 en 70,0.

Conclusies.

Dit is de eerste studie die de weefselconcentratie van B-FABP en H-FABP in verschillende gebieden van het humane hersenweefsel in kaart brengt. Tevens waren B-FABP en H-FABP bij meer patiënten met milde traumatische hersenschade verhoogd dan de huidige markereiwitten S-100B en NSE, wat een hogere gevoeligheid suggereert voor het aantonen van hersenschade.

L.D.Dikkeschei, I.M.Smit-Walraven, A.L.M.Strunk, J.M.Kolk-Dijkman en A.P.Abbes (Zwolle), ‘Real-time’-multiplex-PCR-detectie van 23 verschillende HLA-B27-allelen

‘Ankylosing spondylitis’ (AS) is een reumatische ontstekingsziekte. 90 van alle AS-patiënten hebben het HLA-B27-allel. De overige 10, die het HLA-B27-allel niet hebben, hebben vaak een andere, gerelateerde ziekte zoals psoriasis of inflammatoire darmziekte (IBD), of een anderszins belaste familieanamnese. Indien het HLA-B27-allel dus niet aanwezig is, kan de diagnose ‘AS’ feitelijk uitgesloten worden.

Methoden.

Ondanks dat er veel verschillende technieken zijn om HLA-B27 te typeren, zijn de moleculaire methoden het meest sensitief en specifiek. Twee PCR-technieken worden het meest gebruikt. In de eerste techniek wordt het tweede exon van HLA-B27 geamplificeerd, met behulp van de primerset volgens Olerup. De tweede PCR-techniek amplificeert het derde exon, met behulp van de primerset volgens Dominquez. Echter, de primerset van Olerup amplificeert de subtypen B*2712, B*2716, B*2718 en B*2723 niet. De primerset van Dominquez amplificeert de volgende subtypen niet: B*2707, B*2711, B*2714, B*2719 en B*2721. Bij gebruik van beide primersets kunnen alle subtypen aangetoond worden. Wij hebben een ‘real-time’-multiplex-PCR ontwikkeld, gebruikmakend van de LightCycler-techniek (Roche Diagnostics, Almere), die alle 23 bekende subtypen amplificeert.

Resultaten.

Om alle subtypen te amplificeren wordt gebruikgemaakt van de bovengenoemde primersets en van ?-globine als interne amplificatiecontrole. Tijdens de PCR wordt de amplificatie gevolgd door gebruik te maken van SYBR Green I (Clare Chemical Research, Inc., Dolores, CO, VS). Na de PCR vindt er smeltcurveanalyse plaats, om de amplicons te identificeren.

Conclusies.

De multiplex-PCR op de LightCycler is een snelle en betrouwbare analyse voor de detectie van alle momenteel bekende 23 subtypen van HLA-B27.

I.M.L.W.Keularts, S.Beguin en H.C.Hemker (Rotterdam), Gekalibreerde, geautomatiseerde trombinegeneratiecurve; een nieuwe klinische functie-/screeningstest voor het integrale stollingssysteem

Het stollingssysteem in vivo is zo complex dat zijn functie niet goed wordt weerspiegeld door een of meer stollingsfactorconcentraties of bloedplaatjeseigenschappen.

Methoden.

De trombinegeneratiecurve (het ‘trombogram’) werd vanouds gebruikt om de stolbaarheid van bloed als geïntegreerd systeem te bestuderen. Verhoging van trombinegeneratie (TG) met > 10 duidt op een verhoging van het tromboserisico, verlaging ervan met > 70 wijst op een verhoging van het bloedingsrisico. De klassieke TG-bepaling is echter te arbeidsintensief voor routinegebruik. Met de ‘calibrated automated thrombin generation’ kunnen zowel in plaatjesarm als plaatjesrijk plasma 48 curven gelijktijdig bepaald worden, hetgeen toepassing in het klinisch-hematologisch laboratorium mogelijk maakt. Door variatie van de weefselfactor(TF)- en de trombomoduline(TM)-concentratie kunnen afwijkingen nader gelokaliseerd worden.

Resultaten.

Hyperprotrombinemie (G20210A), remmerdeficiënties (antitrombinen, proteïne-S, -C) en geactiveerd-proteïne-C(APC)-resistentie verhogen TG. Lupusanticoagulans veroorzaakt een late start (stollingsremming) en verhoogde trombinevorming (tromboseneiging). Deficiënties van alle stollingsfactoren (inclusief Von Willebrandfactor en fibrinogeen), trombocytopenie, trombocytopathie (Glanzmann, Bernard-Soulier) zowel als antistollingsbehandeling (heparinen (ook laagmoleculairgewichtheparinen), orale antistolling, directe trombineremmers) en plaatjesremmers (abciximab, clopidogrel) verlagen het trombogram. Effectieve orale antistollingstherapie remt het trombogram 60-80. Ook combinatietherapie kan gevolgd worden (bijvoorbeeld heparine plus orale anticoagulantia (OAC), OAC en antiplaatjesmedicatie).

Conclusies.

Met het trombogram kan men dus: (a) hyper- en hypocoagulabiliteit opsporen, onafhankelijk van de oorzaak en (b) bepalen in welk areaal van het stollingsproces een gevonden afwijking gelokaliseerd moet worden. Dit vermindert de noodzaak om een groot aantal specifieke bepalingen uit te voeren.

H.Baadenhuijsen, A.Kuypers, C.Weykamp, C.Cobbaert en R.Jansen (Nijmegen), Selectie, bereiding en karakterisering van commuteerbaar referentiemateriaal voor kalibratie van enzymbepalingen. Studie in het kader van het project ‘Kalibratie 2000’

In het project ‘Kalibratie 2000’ wordt gestreefd naar het harmoniseren van laboratoriumresultaten via kalibratie door middel van het ontwikkelen van commuteerbare, matrixgebaseerde secundaire referentiematerialen. De selectie, bereiding en karakterisering van geschikt referentiemateriaal voor de kalibratie van de 6 routinematig gemeten enzymen wordt beschreven.

Methoden.

Poolsera afkomstig van patiënten en verschillende kandidaatmaterialen werden door 37 deelnemende laboratoria geanalyseerd. De resultaten van ieder laboratorium werden geëvalueerd in het licht van de resultaten van een referentiemethode door middel van regressieanalyse. Het materiaal met de meest geschikte eigenschappen, bestaande uit gevriesdroogd poolserum met toegevoegde recombinante humane enzymen, werd verkozen tot nationale enzymkalibrator. De bevroren versie van dit materiaal (zonder sucrose als cryoprotector) werd tevens ingezet als extern controleserum in rondzendingen van de Stichting Kwaliteitsbewaking Medische Laboratoriumdiagnostiek. De resultaten van ‘gekalibreerde’ en ‘niet-gekalibreerde’ laboratoria werden vergeleken met de percentuele tussenlaboratoriumspreiding (variatiecoëfficiënt, VC) als maat.

Resultaten.

De resultaten uit de meest recente rondzendingen met gegevens van toegestuurd regulier serum (met toegevoegde enzymen van niet-humane oorsprong) en van het speciaal bereide natieve serum (met toegevoegde recombinantenzymen van humane oorsprong) van zowel gekalibreerde als niet-gekalibreerde laboratoria waren als volgt: de reguliere monsters vertoonden een gemiddelde tussenlaboratorium-VC voor alle 6 enzymen (laag-hoog) van 5,4-10,9 voor de niet-gekalibreerde laboratoria versus 3,9-9,1 voor de 44 gekalibreerde laboratoria. Voor de speciaal bereide serummonsters was deze spreiding respectievelijk 5,3-9,0 en 2,7-4,7, waarbij de laatstgenoemde spreiding zowel het gunstige effect van kalibreren aangeeft als tevens het belang benadrukt van het gebruik van de juiste monsters om dit effect te illustreren.

Conclusies.

Wij zijn in staat geweest potentieel secundair referentiemateriaal met goede commuteerbaarheid voor de 6 betrokken enzymen te ontwikkelen. Duidelijk bleek dat de reguliere monsters zich beduidend slechter gedragen dan de meer natieve monsters en daardoor niet geschikt zijn voor controle van de juistheid van de laboratoriumuitslagen.

C.Klomp, A.P.Abbes en H.Engel (Zwolle), De cel-I-mutatiedetectietechniek: 100 sensitiviteit in het detecteren van puntmutaties in genomisch DNA

In het verleden zijn vele enzymen en technieken beschreven die werden aangewend voor het opsporen van mutaties in genomisch DNA. Ondanks deze vele pogingen is er geen enzym of techniek voorhanden die een hoge sensitiviteit toont in het screenen op het voorkomen van mutaties. Recent is een nieuw enzym, het endonuclease cel I, dat geëxtraheerd wordt uit selderij, beschreven voor het detecteren van mutaties. Het cel I is uniek omdat het DNA kan knippen bij voorkeur op de plaats van een mismatch in heteroduplexen. Het cel I detecteert 100 van de aanwezige sequentievarianten inclusief deleties, inserties en basesubstituties.

Methoden.

In de cel-I-mutatiedetectieassay wordt de eerste PCR van het target-DNA gevolgd door een tweede PCR met primers die gelabeld zijn met een fluorescerende kleurstof. Na heteroduplexvorming waarbij vooraf het DNA wordt gemengd met ‘normaal’ DNA worden de PCR-producten geïncubeerd met cel-I-endonuclease, dat een speciale voorkeur heeft voor het knippen van de mismatches. De splitsingsproducten (mutaties of polymorfismen) worden daarna gedetecteerd met behulp van elektroforese op een DNA-sequencer. De mutatie wordt gedetecteerd als een verdikte of extra band op de gel.

Resultaten.

Meer dan 20 verschillende mutaties in enkele honderden PCR-producten zijn getest. Bovendien zijn vele exonen gescreend op het voorkomen van mutaties bij patiënten met erfelijke ziekten zoals de ziekte van Wilson, familiaire mediterrane koorts en familiaire neurohypofysaire diabetes insipidus. Reeds vooraf bekende mutaties werden allemaal gedetecteerd. Ook werden nieuwe mutaties geïdentificeerd door het sequencen van verdachte DNA-producten. De cel-I-mutatiedetectietechniek spoort de mutaties op met 100 sensitiviteit en 100 specificiteit.

Conclusies.

De resultaten demonstreren dat de cel-I-mutatiedetectietechniek een zeer gevoelige techniek is voor het opsporen van puntmutaties in genomisch DNA.