Laboratoriumdiagnostiek van Lyme-borreliose

Bij Lyme-borreliose kennen wij diverse klinische stadia.1 In de acute fase, ongeveer 1 tot 2 weken na de tekenbeet, zien wij voornamelijk dermatologische afwijkingen in de vorm van erythema chronicum migrans en lymphadenosis cutis benigna. In die periode zijn ook systemische verschijnselen waar te nemen. Patiënten klagen vaak over hoofdpijn, algemeen onwelbevinden, rugpijn en spierpijn, kortom, zij voelen zich ‘grieperig’. In de tweede, intermediaire fase, 4 tot 9 weken na de infectie, staan neurologische en cardiovasculaire klachten,2 en myositis op de voorgrond. Zoals bekend, ontstaat bij lang niet alle patiënten na de acute fase een intermediaire fase, maar het exacte percentage kennen wij niet. Het is wel duidelijk dat neurologische aandoeningen vaker in Europa voorkomen dan in Amerika. Na de intermediaire fase kan na maanden tot jaren een chronische fase ontstaan. Hierbij staan op de voorgrond artritisklachten, lage rugpijn, dermatologische aandoeningen, waaronder acrodermatitis chronica atrophicans,3 en chronische neurologische klachten, vooral van centrale aard.

Diagnostiek: 2-testprotocol

Voor de diagnostiek van Lyme-borreliose zijn onlangs door de Centres for Disease Control (CDC) richtlijnen uitgevaardigd die een zogenaamd 2-testprotocol voorstaan.4 Overal ter wereld tobt men met de problematiek van de inadequate serologische uitslagen, die enerzijds geen uitsluitsel geven over de klinische beelden die wij mogelijk in verband moeten brengen met Lyme-borreliose en die anderzijds Borrelia ten onrechte aan klinische beelden koppelen die niets met een infectie door de Lyme-spirocheet te maken hebben. Wanneer men de literatuur daarop doorleest, zijn er wel 40 neurologische beelden die ooit in verband zijn gebracht met Lyme-borreliose.

Bij het 2-testprotocol moet men gebruikmaken van 2 verschillende methoden voor diagnostiek, waarbij de tests complementair aan elkaar zijn. Bij een positieve uitslag van beide tests mag men dan de diagnose ‘Lyme-borreliose’ stellen, ook al voldoet de kliniek niet aan de eerder door de CDC gestelde criteria.

Kweek

Bij de diagnostiek van Lyme-borreliose kunnen wij diverse methoden gebruiken. De eerste en beste methode is het aantonen van de bacterie met een kweek. Het is mogelijk om in alle stadia van de ziekte uit getroffen weefsel de Lyme-spirocheet te kweken. Dit is echter moeilijk en tijdrovend en het wordt slechts op enkele plaatsen in Nederland routinematig uitgevoerd. Om die reden neemt men vaak zijn toevlucht tot serologische bepalingen.

Antistoffen

Bij infectie met de Lyme-spirocheet zien wij in een vroeg stadium een T-celrespons en in een wat later stadium een specifieke antistofrespons. Als eerste verschijnt specifiek IgM in de circulatie, maar niet eerder dan ongeveer 6 weken na de infectie; vervolgens is er specifiek IgG, dat men niet mag verwachten vóór de 6e tot 8e week. Dat betekent dat een patiënt een betekenisvolle titer pas ongeveer 2 maanden na de infectie opbouwt. De antistoftiter kan met een ELISA of een immuunfluorescentietest worden bepaald.

De Lyme-spirocheet is een bijzonder ingewikkeld gebouwd micro-organisme. De specifieke antistofrespons is de resultante van diverse antistoffen tegen diverse bacteriële antigenen en een complicerende factor daarbij is dat niet tegen alle antigenen in dezelfde fase van de ziekte antistoffen worden gemaakt. Wij kennen vroege en late antistoffen. Een voorbeeld van een vroege antistof is die tegen het proteïne met een molecuulmassa van 41 kD, dat is het flagellaire antigeen. Bij de serologische tests brengt men serum van patiënten in contact met antigeencomplexen van de spirocheet, waarna men kijkt of er antistoffen aan die complexen zijn blijven kleven, een teken van een specifieke antigeen-antilichaamreactie. Tot op de dag van vandaag maakt men daarbij vaak gebruik van antigeencomplexen, uitgaande van een antigeenmengsel bereid uit hele spirocheten. Enkele commerciële testkits maken echter gebruik van monospecifieke antigenen, in casu het 41-kD-flagelline. De stam die voor bereiding van de antigene suspensies wordt gebruikt, is in het algemeen de Amerikaanse referentiestam, de stam die ooit door Willy Burgdorfer zelf is beschreven. In theorie is deze stam voor serologische bepalingen in Europa minder geschikt nu bekend is dat binnen de species Borrelia burgdorferi een aantal subspecies te herkennen is, die qua structuur verschillen (B. burgdorferi ‘sensu stricto’, B. garinii en B. afzelii). In Europa komen B. afzelii en B. garinii veel vaker voor dan B. burgdorferi ‘sensu stricto’, de stam die het meeste lijkt op de originele Amerikaanse B. burgdorferi-‘sensu lato’-stam. Het verschil in epidemiologie en het verschil in klinische presentatie van verschillende patiënten met Lyme-borreliose is mogelijk terug te voeren op verschil in vóórkomen van deze subspecies in Amerika en Europa. B. garinii wordt vooral in verband gebracht met neurologische afwijkingen, B. afzelii juist met huidafwijkingen, zoals erythema chronicum migrans en acrodermatitis chronica atrophicans.5 Men kan zich voorstellen dat vanwege het verschil in antigene samenstelling van Europese stammen ook de serologische reactie van patiënten niet optimaal is als de Amerikaanse stam bij de test wordt gebruikt.

Naast het flagellaire antigeen zijn er ook diverse antigene buitenmembraaneiwitten die immunodominant zijn (daartegen maken de meeste patiënten antistoffen). De bekendste daarvan zijn Osp A, Osp B en Osp C. Ze komen in wisselende mate voor bij de diverse Borrelia-stammen. Van Osp A kennen wij nog diverse serotypen. Osp C is een antigeen dat veel voorkomt binnen het genus Borrelia, maar niet karakteristiek is voor B. burgdorferi. Antistoffen tegen Osp C zijn eveneens ‘vroege antistoffen’. De antistoffen tegen Osp A en Osp B zijn bactericide (in vitro) en bij diermodellen is het mogelijk immuniteit op te wekken door te immuniseren met deze buitenmembraaneiwitten. Bij de mens is dit effect echter veel minder duidelijk.

Diverse andere membraaneiwitten kunnen aangewezen worden als immunogenen waartegen specifieke antistoffen bij sommige patiënten kunnen worden gevonden. Bij de late Lyme-borreliose ziet men vaak antistoffen tegen eiwitten met een molecuulmassa van 85 tot 97 kD circuleren. Mogelijk zijn deze antigenen fragmenten van het P100, een membraangebonden eiwit. Meer dan 10 hittelabiele eiwitten (‘heat shock proteins’) zijn aangetoond bij Borrelia. Ook tegen deze antigenen kunnen antistoffen worden aangetroffen, vooral bij patiënten met Lyme-artritis.

Antigene variatie

Problematisch is dat vele van de antigenen kruisreageren met antigenen van andere min of meer verwante bacteriën. Daarnaast blijkt de expressie van diverse eiwitten te variëren. Deze antigene variatie is er de oorzaak van dat men variabele antistoftiters kan vinden bij diverse soorten patiënten en vaak incomplete antistofpatronen aantreft. Deze antigene variatie (ook wel ‘antigeenswitch’ genoemd) is bekend voor Borrelia-soorten.

Ook in het laboratorium kan men na passage in proefdieren expressie van andere antigenen waarnemen. Hierdoor maakt Borrelia zich immunologisch onherkenbaar in zijn gastheer.6 Antistoffen gevormd tegen antigenen die eerst tot expressie kwamen in vivo, herkennen veranderde, later door de spirocheet tot expressie gebrachte antigenen niet. Dit kan leiden tot persistentie van het micro-organisme. Eerstgevormde nog circulerende antistoffen zijn dan ineffectief en niet beschermend meer. Ondanks de aanwezigheid van hoge titers circulerende antistoffen wordt B. burgdorferi bij de patiënt dan niet gedood.

Een complicatie daarbij is nog de meestal intracellulaire lokalisatie van B. burgdorferi, die maakt dat de bacteriën ook vrijwel ontoegankelijk zijn voor circulerende antistoffen. Het is zelfs zo dat patiënten met circulerende antistoffen een tweede infectie met B. burgdorferi kunnen oplopen.

De antistofproductie wordt ernstig belemmerd wanneer een acute infectie met antibiotica wordt behandeld gedurende de periode dat de antistofproductie nog nauwelijks op gang is, dus vóór de 4e week. De spirocheten zijn dan verdwenen voordat het immuunsysteem goed heeft kunnen reageren. Wanneer erythema chronicum migrans met antibiotica wordt behandeld, blijven de antistoffen vaak achterwege of wordt de titer niet hoger dan de ‘achtergrondruis’ die wij in de bevolking aantreffen.7 In de vroege tweede fase ziet men vooral antistoffen tegen het 41-kD-eiwit verschijnen. In het algemeen kan men gedurende de intermediaire en de chronische fase antistoffen van alle subklassen aantonen. Het is niet zo dat antistoffen van de IgM-klasse verdwijnen wanneer specifieke IgG-antistoffen gaan circuleren. Het aantonen van beide soorten antistoffen zegt in het algemeen niets over het stadium waarin de ziekte zich bevindt.

De gefaseerde aanmaak van antistoffen en de complexiteit van de diverse antistoffen geven veel problemen bij de interpretatie van de uitslagen van serologische tests. Een daling van antistoffen tegen het ene antigeen kan gepaard gaan met een stijging van antistoffen tegen het andere, resulterend in een moeilijk interpreteerbare titer met een mengsel van antistoffen. In het kort geven circulerende antistoffen nauwelijks informatie over het stadium van de ziekte en zijn ze niet maatgevend voor het effect van therapie.

Diverse serologische technieken zijn in gebruik bij de bepaling van antistoffen tegen Borrelia, maar de gebruikte antigenen bepalen in grote mate de sensitiviteit en de specificiteit van de tests. Wanneer men als antigeen het 41-kD-eiwit flagelline gebruikt, zal de test in het algemeen zeer gevoelig zijn in de vroege stadia en minder gevoelig in de latere stadia van borreliose. De specificiteit van de test is niet erg hoog, omdat diverse kruisreagerende antistoffen tegen verwante flagellinen, afkomstig van onze commensale flora, interfereren in de test. Deze test zal dus zeker met de nodige reserves moeten worden gebruikt.

Wanneer men gebruikmaakt van een mengsel van antigenen, zal de sensitiviteit in het algemeen hoger zijn dan bij gebruik van een monospecifiek antigeen, maar de specificiteit zal navenant lager zijn, omdat kruisreacties en ‘achtergrondruis’ meespelen. Er zijn Borrelia-tests in gebruik die 25 fout-positief en fout-negatief aangeven.

Daarbij is ook het gebruik van de Amerikaanse stam een punt van discussie. Diverse onderzoekers zijn van mening dat men in Europa eigenlijk de Europese stammen zou moeten gebruiken, omdat de expressie van antigenen bij de Europese stammen verschilt van die bij Amerikaanse stammen en dus ook de productie van specifieke antistoffen anders zal zijn. Daarom zijn immunoblottechnieken ontwikkeld waarbij men complete antistofpatronen tegen diverse antigenen meet.8 Deze technieken zijn evenwel tijdrovend en te ingewikkeld als routinebepaling. ELISA-technieken met gezuiverde antigenen van Europese stammen zouden daarvoor een oplossing zijn.

Bij de interpretatie van uitslagen moet men weten welke tests dan wel antigenen zijn gebruikt om een juiste conclusie te kunnen trekken. Het is belangrijk te weten dat ongeveer 5 van de gezonde donorpopulatie in Nederland serologisch positief is in de routineserologie (‘achtergrondruis’). Een positieve test moet derhalve wel passen bij een klinisch beeld wil men tot de conclusie komen dat de klachten verband houden met Lyme-ziekte.

Antigeendetectie

Histologische kleuring van patiëntenmateriaal is een alternatief om de Borrelia-spirocheet zichtbaar te maken.9 De beperking van deze methode is, dat ze niet specifiek is, omdat men wel kan vermoeden te maken te hebben met Borrelia, maar het definitieve bewijs daarvan met een kleuring niet kan leveren. Dit kan men wel met een immunologische antigeendetectiereactie op klinisch materiaal.

Te weinig wordt gebruikgemaakt van deze techniek bij de diagnostiek van B. burgdorferi. Wanneer het mogelijk is om uit elk klinisch materiaal, mits goed afgenomen, Borrelia te kweken, is het ook mogelijk om in hetzelfde materiaal antigenen met specifieke antistoffen immunologisch aan te tonen.10 Deze techniek is onderontwikkeld, maar biedt een perspectief dat diagnostisch beter is dan de serologie op dit moment. Het is een alternatief voor de polymerasekettingreactie die in sommige laboratoria toegepast wordt. Die is arbeidsintensief, contaminatiegevoelig en duur; de immunologische antigeendetectie is zeker zo gevoelig en ook specifiek, mits goed uitgevoerd; bovendien is ze eenvoudig toepasbaar in het routineonderzoek.

Conclusie

De laboratoriumdiagnostiek van Lyme-borreliose blijft lastig. Slechts zelden zal men een positief isolaat van de spirocheet kunnen verkrijgen, meestal is men aangewezen op serologische bepalingen. Het huidige routineonderzoek moet echter met de nodige reserve worden beoordeeld: een positieve test hoeft niet op Lyme-ziekte te duiden, een negatieve test sluit deze niet uit. Er zijn, ook in Nederland, laboratoria die specifiekere serologische bepalingen verrichten, waaronder immunoblottests. De antigeendetectietest is ondergewaardeerd en kan een waardevolle aanvulling op de klinische diagnostiek betekenen.