Indeling occulte tumorcellen in de lymfklieren bij patiënten met darmkanker onvoldoende betrouwbaar

Inleiding

Lymfogene metastasering is de belangrijkste prognostische factor voor patiënten met darmkanker en vormt een belangrijke pijler voor het TNM-classificatiesysteem.1 De lymfogene metastasering wordt bepaald door alle lymfklieren na de resectie van het coloncarcinoom histopathologisch te beoordelen in een preparaat met een hematoxyline-en-eosine(HE)-kleuring. Echter, in de prognostisch gunstige groep van patiënten met histologisch negatieve lymfklieren krijgt toch 15-25% van de patiënten binnen 5 jaar een lokaal recidief of een afstandsmetastase.2 Dit heeft in experimentele setting geleid tot het gebruik van de schildwachtklier(SWK)procedure bij darmkanker. Hiermee worden lymfklieren geïdentificeerd met de hoogste kans op uitzaaiingen en ontstaat de mogelijkheid om deze te onderzoeken met immunohistochemische technieken op occulte tumorcellen.3-5 Bij het mammacarcinoom heeft het gebruik van de SWK-procedure aangetoond dat de ziekte bij 20% van de histologisch negatieve patiënten wordt geherstadieerd.6 Recentelijk is bij vrouwen met borstkanker met occulte tumorcellen in de SWK aangetoond dat er sprake is van een slechtere 5-jaars ziektevrije overleving.7,8 In de recentste versie van het TNM-classificatiesysteem wordt bij het mammacarcinoom onderscheid gemaakt tussen macrometastasen (diameter > 2 mm; aanduiding: pN1), micrometastasen (diameter: 0,2-2 mm; pN1mi) en losse tumorcellen (diameter < 0,2 mm; pN0).9-12

De verschillende TNM-aanduidingen voor losse tumorcellen

De TNM-classificatie van de Union for International Cancer Control (UICC) gebruikt voor losse tumorcellen zowel kwantitatieve als kwalitatieve criteria.11,12 In deze definitie zijn occulte tumorcellen losse tumorcellen zonder klinische consequentie indien deze kleiner zijn dan 0,2 mm, er geen tekenen zijn van activiteit (geen proliferatie, geen stroma-reactie) en de cellen gelokaliseerd zijn in de lymfatische sinus. Dit betekent dat wanneer losse tumorcellen in het lymfklierparenchym gedetecteerd worden, deze beschouwd worden als micrometastase (aanduiding: pN1mi+).

Echter, in de 6e editie van het TNM-systeem volgens de American Joint Committee in Cancer (AJCC) worden alleen kwantitatieve criteria meegenomen:9,10 tumorcelclusters van 0,2-2,0 mm diameter zijn micrometastasen (aanduiding: pN1mi+), en alle afwijkingen kleiner dan 0,2 mm worden gedefinieerd als losse tumorcellen (aanduiding: pN0itc+).

Naast dit alles kan bij immunohistochemische technieken een fout-positieve aankleuring van hematopoëtische cellen ontstaan, die geen betekenis heeft bij de stadiëring.13

Als het vóórkomen van tumorcellen in de SWK gebruikt gaat worden voor het geven van bijvoorbeeld adjuvante chemotherapie aan patiënten met darmkanker, is het van cruciaal belang dat deze bevinding betrouwbaar is. Daarom onderzochten wij de interobserver-variatie onder Nederlandse pathologen met betrekking tot de classificatie van occulte tumorcellen in de lymfklieren bij patiënten met darmkanker. Om tot aanbevelingen te komen ter verduidelijking van de richtlijnen in de TNM-classificatie werden karakteristieken geïdentificeerd welke geassocieerd zijn met inconsistente diagnosen.

Patiënten en methoden

Patiënten

De onderzoekspopulatie bestond uit 82 opeenvolgende patiënten met een histologische uitslag ‘N0’ na HE-kleuring, die in de periode november 2006-juli 2008 geopereerd werden voor een colorectaal carcinoom in Gelre Ziekenhuizen Apeldoorn. De lymfklieren werden immunohistochemisch geanalyseerd op de aanwezigheid van tumorcellen.

Immunohistochemie

Van gearchiveerde paraffineblokken werden op 3 niveaus met een interval van 500 μm 3 achtereenvolgende coupes (seriecoupes) gesneden en gekleurd met verschillende antilichamen. Om het risico op fout-positieve aankleuring te beperken, maakten wij gebruik van monoklonale antilichamen.

Het antilichaam Ber-EP4 (DAKO, Nederland), gericht tegen celwandglycoproteïnen werd gecombineerd met twee anticytokeratineantilichamen: anticytokeratine 20 (CK20), waarvan de expressie beperkt is tot gastro-intestinale epitheelcellen (Euro Diagnostica, Arnhem), en de anticytokeratinemarker Cam5.2 waarbij de antigenen tot expressie komen in alle epitheelcellen (Becton and Dickinson, Alphen aan den Rijn). De details van de immunohistochemische kleuring staan elders beschreven.14

Onderzoeksopzet

Van 30 immunohistochemisch gedetecteerde afwijkingen in de patiëntenpopulatie werden representatieve foto’s genomen met een digitale camera (Olympus), bevestigd op een conventionele microscoop. Het ging om 28 immunohistochemisch gedetecteerde afwijkingen in de lymfklier en 2 aankleurende celclusters in een aangrenzend vat. Van de afwijkingen werden 1-3 afbeeldingen met verschillende vergrotingen (10x, 20x en 40x) op een afgeschermde website geplaatst, met een maatschaal per foto (http://gelre.wockey.nl). Daaraan werden 7 foto’s toegevoegd van afwijkingen met klein volume, gedetecteerd in HE-preparaten.

Wij vroegen aan 40 at random geselecteerde pathologen uit het adresbestand van de Nederlandse Vereniging voor Pathologie 1 diagnose per foto te geven en aan te geven in hoeverre zij zeker waren van de diagnose. Per foto bestond de mogelijkheid commentaar te geven. De figuur toont een selectie van de foto’s die beoordeeld werden.

Definities voor occulte tumorcellen

In de huidige TNM-classificaties worden occulte tumorcellen onderscheiden in micrometastasen (pN1mi+) en losse tumorcellen (pN0itc+).9-12 De pathologen mochten naar eigen inzicht de afwijkingen beoordelen en hadden de keuze uit de TNM-classificatie van de UICC, die van de AJCC en de eigen richtlijn die verwijst naar de 5e editie van de TNM-classificatie met compendium.9-12

Statistische analyse

De interobserver-variatie tussen de pathologen bij de classificatie van occulte tumorcellen werd bepaald door berekening van de W-coëfficiënt voor overeenstemming volgens Kendall. Deze analyse berekent de betrouwbaarheid van de antwoorden en kansgecorrigeerde mate van overeenstemming in het geval van verschillende beoordelaars.15 De uitersten van de kendall W-coëfficiënt loopt van 0,0-1,0. Een waarde van boven de 0,80 wordt beschouwd als een perfecte overeenstemming (tabel).16

Statistische evaluatie werd verricht met behulp van SPSS versie 15.0 (SPSS INC., Chicago, IL, USA).

Resultaten

Pathologen Van de 40 pathologen namen er 37 deel aan het onderzoek (respons 93%). De antwoorden van 2 pathologen werden geëxcludeerd omdat hun antwoordenlijst incompleet was en omdat geen enkele afwijking geclassificeerd werd, waarbij zij als argument gaven dat voor het coloncarcinoom nog geen onderscheid wordt gemaakt tussen micrometastasen en losse tumorcellen. In totaal bleven 35 antwoordensets over voor analyse (1295 beoordelingen). Alle participanten waren gecertificeerde pathologen, en 3 van hen waren gespecialiseerd in gastro-intestinale oncologie. 8 pathologen waren werkzaam in een academisch ziekenhuis of een gespecialiseerd centrum, en 27 in een niet academische kliniek.

Overeenstemming Bij 5 van de 37 foto’s was er volledige overeenstemming over de diagnose van de afwijking: 3 afwijkingen werden unaniem gekarakteriseerd als ‘micrometastase’ en 2 kleine clusters tumorcellen in een randsinus als ‘losse tumorcellen’. Voor 17 van de 37 beoordeelde foto’s (46%) was het kansgecorrigeerde niveau van overeenstemming slecht tot matig, 9 foto’s (24%) toonden een redelijke overeenstemming en bij 11 foto’s (30%) werd een goede tot perfecte overeenstemming gevonden (kendall W-coëfficiënt > 0,61). Indien de pathologen die aangaven niet zeker te zijn van een diagnose op grond van de foto buiten de analyse werden gelaten, gaf dit een verbetering van de interobserver-variatie met 18 foto’s (49%) die een goede tot perfecte overeenstemming toonden (zie de tabel).

Correlatie discrepante diagnosen met tumorcelkenmerken

Van de 26 foto’s met een kendall W-coëfficiënt < 0,6 werden de kenmerken van de beoordeelde afwijkingen geanalyseerd. Bij 16 afwijkingen betrof het een klinisch relevant onderscheid (losse tumorcellen pN0 of artefact, versus micrometastase pN1). Dit bleek voornamelijk geassocieerd met het vóórkomen van multifocale afwijkingen, waarbij voor 8 foto’s werd aangegeven dat het onduidelijk was of de desbetreffende multifocale afwijkingen opgeteld moesten worden. Bij 3 afwijkingen werd de matige overeenstemming veroorzaakt doordat sommige pathologen een afwijking kleiner dan 0,2 mm bewust classificeerden als micrometastase op basis van tumorcelkenmerken of een lokalisatie van de afwijking in het parenchym. 2 afwijkingen met klinisch relevant verschil in diagnose waren rond de 0,2 mm in diameter en hierbij berustte de discrepantie waarschijnlijk op meetverschillen. Eén afwijking werd door sommige pathologen als een micrometastase gescoord terwijl andere pathologen deze tumorcellen als contaminatie classificeerden op basis van hun ligging aan de rand van de lymfklier. 2 foto’s met een slechte overstemming (kendall W-coëfficiënt: 0,06) toonden een tumorembolus in een bloedvat. Deze afwijking werd geclassificeerd op verschillende manieren: als een micrometastase op basis van ligging, als losse tumorcellen door de afmeting en als vaso-invasieve groei (geen metastase).

De overige 10 afwijkingen met een slechte overeenstemming betroffen voornamelijk diagnostische verschillen in losse tumorcellen, artefacten of contaminatie.

Commentaar bij de foto’s

Hoewel door de beoordelende pathologen werd bevestigd dat het een representatieve serie afwijkingen betrof met duidelijke foto’s, werd het op deze manier classificeren van afwijkingen in enkele gevallen lastiger gevonden dan met behulp van een microscoop in de dagelijkse praktijk. Bij 5 van de in totaal 1295 beoordelingen werd aangegeven dat dit voornamelijk kwam doordat men op de foto’s geen diepte kon zien en er geen mogelijkheid was de afwijkingen te vergelijken met de primaire tumor. Dit kon een rol spelen bij de slechte overeenstemming die werd gevonden bij de 10 afwijkingen waarbij men twijfelde tussen losse tumorcellen, contaminatie of artefacten. Wellicht speelde dit ook bij de slechte of matige overeenstemming bij 16 foto’s tussen de diagnose ‘micrometastase’ en ‘losse tumorcellen’ omdat hierbij voornamelijk de ligging en de afmeting van de afwijking en het optellen van multifocale afwijkingen belangrijke criteria zijn. Deze aspecten waren op de foto’s met een meetschaal juist goed te beoordelen.

Daarnaast werd door de pathologen aangegeven dat het in de praktijk onduidelijk is welke scoringscriteria gehanteerd moeten worden.

Beschouwing

Ons onderzoek toonde aan dat het betrouwbaar classificeren van occulte tumorcellen in lymfklieren bij patiënten met darmkanker lastig was. 70% van de beoordelingen had een slechte, matige of redelijke kansgecorrigeerde overeenstemming tussen de beoordelende pathologen (kendall W-coëfficiënt < 0,6). Twee eerdere onderzoeken naar de reproduceerbaarheid van de diagnose ‘occulte tumorcellen’ bij het mammacarcinoom laten ook teleurstellende bevindingen zien.17,18 In 5 casussen werd in ons onderzoek aangegeven dat het lastig was een zekere diagnose te stellen omdat de mogelijkheid ontbrak diepte te zien en er geen vergelijking gemaakt kon worden met de oorspronkelijke tumor. Dit vormt deels een verklaring voor de matige betrouwbaarheid.

In ons onderzoek, met behulp van foto’s, hoefden de beoordelaars niet zelf te zoeken naar de afwijkingen hetgeen de reproduceerbaarheid van de afwijkingen in lymfklieren ten goede kwam ten opzichte van de dagelijkse praktijk. Voorgaande onderzoeken laten zien dat ook de frequentiedetectie van klein-volumeafwijkingen wisselend is en afhankelijk van factoren als vermoeidheid en ervaring van de patholoog.19,20 Door bij de foto’s een maatschaal te plaatsen werden ook eventuele individuele methodologische meetverschillen op coupes voorkomen.

Daarnaast hadden de pathologen de mogelijkheid om per foto aan te geven of zij zeker waren van hun diagnose. Als de onzekerheid over de beoordeling van afwijkingen de oorzaak zou zijn van de matige betrouwbaarheid, zou men verwachten dat dit resultaat verbeterde na analyse van pathologen die aangaven dat het een zekere diagnose betrof. Hoewel het percentage foto’s met een goede overeenstemming (kendall W-coëfficiënt: 0,6-1,0) inderdaad steeg van 30% naar 49%, bleef bij ruim de helft van de foto’s de overeenstemming slecht tot matig.

Bij het interpreteren van de resultaten werden 2 groepen onderscheiden in de 26 foto’s met een matige overeenstemming: klinisch relevante verschillende diagnosen (losse tumorcellen pN0itc versus micrometastasen pN1mi+) (n = 16) en het onderscheiden van fout-positieve aankleuring versus losse tumorcellen (n = 10). In de eerste groep bleek de matige overeenstemming samen te hangen met onduidelijkheid in de TNM-classificatie ten aanzien van het optellen van multifocale afwijkingen. Een ander probleem bij het classificeren van klein-volumeafwijkingen is het verschil in AJCC- en UICC-criteria. Doordat de UICC naast kwantitatieve criteria ook maligne activiteit en ligging meeneemt, kunnen afwijkingen kleiner dan 0,2 mm toch geclassificeerd worden als klinisch relevante micrometastasen.11,12 Door sommige pathologen werd aangegeven dat bij kleine afwijkingen soms bewust werd gekozen voor deze classificering omdat zij een bepaalde afwijking kleiner dan 0,2 mm toch als klinisch relevant interpreteerden. Echter, zowel bij het mammacarcinoom als bij het colorectaal carcinoom is nog geen prognostische relevantie aangetoond voor afwijkingen kleiner dan 0,2 mm.5,20 Voor een uniforme beoordeling lijkt het dus wenselijk bij kleine afwijkingen de AJCC-criteria aan te houden en afwijkingen kleiner dan 0,2 mm als losse tumorcellen te categoriseren. Dit sluit ook aan bij het TNM-compendium dat stelt dat bij twijfel een lagere categorie wordt gekozen.

Een recent onderzoek bij patiënten met borstkanker toont aan dat de aanwezigheid van lymfkliermetastasen kleiner dan 2 mm geassocieerd is met een slechtere overleving.8 De auteurs concluderen echter dat in de gebruikte literatuur een onduidelijk onderscheid wordt gemaakt in klein-volumeafwijkingen en dat voor toekomstig prognostisch onderzoek dit onderscheid essentieel is. Een beter onderscheid is mogelijk door het opstellen van duidelijker richtlijnen en door training van pathologen.18 Dit geldt echter niet voor het onderscheiden van fout-positieve aankleuring en losse tumorcellen. Hoewel dit verschil klinisch minder relevant is, geeft de door ons gevonden slechte betrouwbaarheid bij 10 foto’s wel aan dat selectieve antilichamen noodzakelijk zijn om fout-positieve aankleuring te voorkomen.22

Conclusie

Het onderscheid tussen micrometastasen en losse tumorcellen in lymfklieren van patiënten met darmkanker was in ons onderzoek niet eenduidig. Dit kwam door het gebruik van verschillende classificatiesystemen en onduidelijkheden in de huidige richtlijnen met betrekking tot het optellen van afwijkingen. Als de bevinding van occulte tumorcellen gebruikt gaat worden voor het geven van adjuvante chemotherapie is het noodzakelijk om betere definities van occulte tumorcellen te maken en in classificaties op te nemen.

Leerpunten

• Bij de schildwachtklierprocedure kunnen in lymfklieren occulte tumorcellen worden gevonden.

• Deze tumorcellen worden ingedeeld als micrometastase of als losse tumorcellen.

• Door deze procedure kan de stadiëring van patiënten met darmkanker verbeteren hetgeen de keuze voor eventuele adjuvante chemotherapie kan bepalen.

• De classificatie van occulte tumorcellen in lymfklieren blijkt echter moeilijk te zijn: bij 70% van de aan pathologen voorgelegde microscopische beelden was de onderlinge overeenstemming slecht tot redelijk.

• Als deze indeling voor de behandeling van darmkanker zal worden gebruikt moeten er betere definities komen.