Draagsterschaponderzoek voor het Wiskott-Aldrich-syndroom met behulp van restrictiefragmentlengte-polymorfisme-analyse
Open

Onderzoek
06-05-1990
M. de Weers, G.J.C.M. Kolvenbag, I.F.A.M. Versteegde, R.W. Hendriks, L.A. Sandkuyl en R.K.B. Schuurman

Het Wiskott-Aldrich-syndroom (WAS) is een ernstige geslachtsgebonden immunodeficiëntieziekte. Het WAS-gen is gelokaliseerd met behulp van restrictiefragmentlengte-polymorfismen(RFLP): het gen ligt op de korte arm van het X-chromosoom tussen de merkstoffen DXS7 en DXSI4. Koppeling van het WAS-gen met deze merkstoffen heeft draagsterschaponderzoek en prenatale diagnostiek mogelijk gemaakt. Toepassing van deze onderzoekmethode wordt beschreven voor 3 vrouwen uit een familie waarin in 2 generaties WAS-patiënten voorkomen. Met meer dan 98,5 zekerheid kon worden vastgesteld dat zij geen draagsters zijn.

Inleiding

Het Wiskott-Aldrich-syndroom (WAS) is een zeer ernstige geslachtsgebonden immuundeficiëntie die gepaard gaat met ernstige recidiverende en persisterende voornamelijk bacteriële infecties, eczeem en een sterke bloedingsneiging als gevolg van trombopenie. Van de aangedane jongens is de gemiddelde levensverwachting 5-6 jaar.1-2 Bij oudere kinderen met dit syndroom ontwikkelen zich vaak lymforeticulaire tumoren en leukemieën.

Het syndroom wordt gekenmerkt door progressieve T-lymfocytenfunctiestoornissen;3 zowel het aantal T-lymfocyten als hun functie neemt af. De stoornissen in de B-lymfocytenfunctie bestaan uit een verminderde antilichaamproduktie tegen polysaccharide-antigenen, verhoogde IgA- en IgE-gehalten in het serum, en een verlaagde IgM-produktie.4 Op de celmembranen van de leukocyten en de trombocyten van patiënten met WAS ontbreekt een sialoglycoproteïne, het CD43-molecuul.56 Dit molecuul zou van belang zijn bij de activatie van T-cellen.78

Aangezien WAS een recessieve geslachts(X-)gebonden aandoening is, zijn prenatale diagnostiek en draagsterschaponderzoek relevant voor vrouwen uit families met dit syndroom. Doordat draagsters geen meetbare immunologische afwijkingen hebben, was genetische advisering tot voor kort beperkt tot een kansberekening op basis van stamboomanalyse. Uit restrictiefragment-lengte-polymorfisme(RFLP)-studies bleek dat het WAS-gen gelegen was op de korte arm van het X-chromosoom in band Xp 11.3 tussen de RFLP-merkstoffen DXS7 en DXS14.9-11 Met behulp van deze merkstoffen kan het WAS-gen binnen een familie gevolgd worden.10

In dit artikel worden resultaten weergegeven van de toepassing van deze onderzoekmethode bij 3 vrouwen uit een familie waarin in 2 generaties patiënten met WAS voorkomen. Met meer dan 98,5 zekerheid kon worden vastgesteld dat zijn geen draagsters zijn.

PATIËNTEN EN METHODEN

In de familie van 3 adviesvraagsters kwamen 4 patiënten met WAS voor die allen als karakteristieke symptomen hadden: trombocytopenie, eczeem en immunodeficiëntie (figuur).

ZIEKTEGESCHIEDENISSEN

Patiënt A (II.1) had direct na de geboorte petechiën, anemie en trombocytopenie. Een maand later kreeg hij eczeem in de elleboogplooien en had hij melaena. De trombocytopenie (68 x 109l) ging gepaard met een normaal trombocytenaggregatiepatroon. Na de tweede levensmaand ontstonden lymfadenopathie en recidiverende infecties in de hogere luchtwegen, de urinewegen en het maag-darmkanaal. Het eczeem verergerde. Als gevolg van de trombocytopenie (het aantal trombocyten daalde tot minder dan 10 x 109l) ontstonden petechiën, gingivale contactbloedingen, bloedingen in het maag-darmkanaal en anemie met reticulocytose. Op de leeftijd van 10 maanden kwam herhaaldelijk hematemesis voor en bestond er behalve een gegeneraliseerde lymfadenopathie een hardnekkige stomatitis. De patiënt overleed aan intracraniële bloedingen.

Patiënt B (II.9) had bij de geboorte anemie (Hb-gehalte 7,6 mmoll) en enkele petechiën bij een trombocytopenie (65 x 109). Twee maanden later ontwikkelde zich een uitgebreid eczeem. Er deden zich recidiverend otitiden, bronchitiden, pneumonieën en urineweginfecties voor, telkens gepaard gaande met exacerbaties van het eczeem. Patiënt had rectaal bloedverlies en incidenteel neus-, oog- en urethrabloedingen. Hij werd behandeld met antibiotica, gammaglobulines en trombocytentransfusies. Op de leeftijd van 5 maanden toonde hij petechiën, een hematoom van het middenoor, eczeem, hepatosplenomegalie, anemie en trombocytopenie (90 x 108l). Hij overleed als gevolg van een intracraniële bloeding op de leeftijd van 11 maanden.

Patiënt C (III.1) toonde op de leeftijd van 2 maanden gastrointestinaal bloedverlies en een ernstige anemie met reticulocytose. Trombocyten waren in aantal sterk verlaagd, bij normale bloedings- en stollingstijd. Eén maand later ontstonden petechiën, purulente rinitis, bronchitis en abcessen aan het hoofd. Ondanks antibiotische behandeling breidde een pneumonie die was ontstaan zich uit tot empyeem. Op de leeftijd van 5 maanden overleed patiënt aan een stafylokokkensepsis.

Bij obductie werden een trombocytopenie bij megakaryocytose, een lymfocytendepletie in milt- en lymfeklieren, en enige reticulohistiocytaire proliferatie in lymfeklieren en beenmerg gevonden. Diverse infecties in de vorm van onder andere abcessen, pneumonie en sepsis waren veroorzaakt door Staphylococcus aureus en Cytomegalovirus. Er werden in de longen vele kolonies met Pneumocystis carinii aangetroffen.

Patiënt D (III.2) had bij de geboorte trombocytopenie en petechiën. Hij maakte multipele bacteriële infecties door van de hogere en lagere luchtwegen en van de urinewegen, en had een persisterende infectie met het Cytomegalovirus. Patiënt had regelmatig neusbloedingen. Door de recidiverende longinfecties ontstonden ernstige bronchiëctasieën. Op 7½-jarige leeftijd maakte hij een Pseudomonas-sepsis door en kreeg hij een licht eczeem. Als gevolg van trombocytopenie deden zich vaak hematomen, bloedingen uit de urethra en anemie voor. Op 9-jarige leeftijd overleed patiënt aan een hersenbloeding.

Stamboom en familie-onderzoek.

Moeder (I.2) en zus (II.2) van de adviesvraagsters (II.5-7) waren obligate draagsters van het WAS-gen: beiden hadden 2 zonen met het WAS (zie figuur). Omdat het WAS-gen recessief X-chromosomaal overerft, hadden de adviesvraagsters een a priori-kans van 50 draagster te zijn.

RFLP-analyse.

Van de familieleden I.1, I.2, II.2-8 en III.3 werd genomisch DNA geïsoleerd uit granulocyten na Ficoll-scheiding. DNA-samples (circa 8 µg) werden gedigesteerd met de restrictie-enzymen Msp I en Taq I. De fragmenten werden gescheiden met behulp van gelelektroforese in 0,7 agarose. Het DNA werd vervolgens overgebracht op een nylon membraan (GeneScreen Plus).12 De membraanfilters werden gehybridiseerd met de radioactief gelabelde probes in hybridisatievloeistof met 50 formamide.12

De informatieve allelen werden als volgt benoemd: A,a voor DXS7 en B,b voor DXS14. Het grootste fragment wordt met een hoofdletter aangeduid, het kleinste fragment met een kleine letter. Voor beide RFLP-merkstoffen geldt een recombinatiekans ten opzichte van het WAS-gen van 8.10

RESULTATEN

De moeder (I.2) bleek heterozygoot te zijn voor beide RFLP-merkstoffen: DXS7: A,a en DXS14: B,b (zie figuur). De fase van I.2 was onbekend. Zij kon de volgende haplotypen hebben: A,Ba,b of A,ba,B. Voor het eerste haplotype was slechts 1 recombinatie nodig (II.4), terwijl men het tweede alleen kon verklaren met 6 recombinaties (II.2, II.3, II.5, II.6, II.7 en II.8). Het meest waarschijnlijke haplotype voor I.2 was dus A,B a,b.

De zus (II.2) had het haplotype A,bA,B. Het allel A,b was afkomstig van haar vader (I.1), het allel A,B van haar moeder. Omdat I.1 en II.2 obligate draagsters waren, kon worden geconcludeerd dat het WAS-gen met de allelen A en B op 1 chromosoom lag.

De adviesvraagsters II.5-7 hadden het volgende haplotype: A,ba,b. De allelen A en b waren afkomstig van de vader (I.1), de allelen a en b van de moeder. Omdat het WAS-gen gekoppeld was aan het andere maternale haplotype (A, B), kon worden geconcludeerd dat de adviesvraagsters geen draagsters waren van het WAS-gen. Tussen de beide RFLP's had geen recombinatie plaatsgevonden, zodat de onbetrouwbaarheidskansen van 8 met elkaar vermenigvuldigd mochten worden. Bij de berekening van de betrouwbaarheid waarmee een uitspraak over draagsterschap werd gedaan, moest ook rekening worden gehouden met het feit dat de fase van I.2 niet voor 100 bekend was (dat wil zeggen dat men niet voor 100 zeker wist op welk X-chromosoom het WAS-gen lag). Voor de 3 adviesvraagsters uit deze familie betekent dit, dat met 98,5 zekerheid gezegd kon worden dat zij geen draagster zijn.

BESCHOUWING

Draagsters van het WAS-gen hebben klinisch, hematologisch en immunologisch geen afwijkingen, omdat het intacte X-chromosoom (het X-chromosoom zonder het WAS-defect) normale functies met zich meebrengt. Draagsterschaponderzoek beperkte zich tot kansberekening op basis van stamboomonderzoek (dochters van obligate draagsters hebben een a priori-kans van 50 dat zij draagster zijn), en prenatale diagnostiek tot bepaling van het geslacht bij risicodragende zwangerschappen. Onlangs is door RFLP-onderzoek de lokalisatie van het WAS-gen bepaald op de korte arm van het X-chromosoom in band XpII.3 tussen de RFLP-merkstoffen DXS7 en DXS14. Door de overerving van deze RFLP-merkstoffen te volgen zijn nauwkeurige bepaling van draagsterschap en prenatale diagnostiek mogelijk.10 Deze methode werd toegepast voor de 3 adviesvraagsters bij wie in de familie 2 generaties met WAS-patiënten voorkwamen.

Het voordeel van 2 RFLP-merkstoffen aan weerszijden van het WAS-gen werd in deze familie getoond. De recombinatiekansen tussen beide RFLP-merkstoffen en het WAS-gen zijn telkens 8. Wanneer geen recombinatie kan worden aangetoond, mag men deze (onbetrouwbaarheids)kansen met elkaar vermenigvuldigen, zodat de betrouwbaarheid waarmee een uitspraak wordt gedaan, sterk toeneemt. Een probleem ontstaat als er wel recombinatie heeft plaatsgevonden tussen de beide RFLP-merkstoffen. Omdat men niet kan bepalen waar de recombinatie ten opzichte van het WAS-gen is opgetreden, is het in dergelijke situaties niet mogelijk een uitspraak over draagsterschap te doen. Wanneer er RFLP-merkstoffen worden gevonden die dichter bij het WAS-gen liggen, wordt de kans op recombinatie kleiner en wordt de betrouwbaarheid van deze methode vergroot.

In de onderzochte familie was de fase van I.2 niet voor 100 bekend. Hiermee moet rekening worden gehouden bij de betrouwbaarheid waarmee een uitspraak over draagsterschap wordt gedaan. Deze berekeningen zijn nogal omvangrijk;13 ze zullen hier niet worden besproken. Van de 3 adviesvraagsters kon met 98,5 zekerheid worden gezegd dat zij geen draagster zijn.

Een probleem kan zich voordoen als de vrouw in de eerste generatie geen obligatie draagster is. Wellicht is er dan een mutatie in één van beide X-chromosomen van deze vrouw ontstaan. Een andere mogelijkheid is dat de mutatie een generatie eerder is ontstaan. Het WAS-gen dragende chromosoom kan afkomstig zijn van zowel haar moeder als haar vader. Paternale transmissie via een gezonde man is eerder beschreven voor de ziekte van Duchenne,1415 hemofilie A,16 fragiele-X-syndroom,17 en onlangs ook voor X-gebonden agammaglobulinemie.18 Draagsterschap kan in dergelijke situaties worden bepaald met behulp van X-inactivatiestudies.18-21

Bij vrouwen is in alle cellen slechts 1 van de 2 X-chromosomen actief. Inactivatie van een X-chromosoom gebeurt willekeurig. Wanneer een X-chromosoom eenmaal geïnactiveerd is, blijft ook in de dochtercellen steeds dat X-chromosoom inactief. In WAS-draagsters zal de T-celpopulatie, met het aangedane X-chromosoom actief, uit het perifere bloed zijn verdwenen. De T-cellen in het perifere bloed tonen daardoor een exclusieve inactivatie van het X-chromosoom waarop het WAS-gen is gelegen. Met behulp van fusie-experimenten, waarbij de T-cellen worden gefuseerd met een geschikte fusiepartner, kan het actieve X-chromosoom worden geselecteerd. Na fusie kan met RFLP-studies worden nagegaan of er sprake is van random X-inactivatie (beide X-chromosomen worden in de hybridomen teruggevonden) of van exclusieve inactivatie van een X-chromosoom. Deze methode geeft een 100 betrouwbare uitslag, maar is tijdrovend.

Het grote voordeel van het RFLP-onderzoek is dat men het WAS-gen kan volgen onafhankelijk van klinische, immunologische en serologische afwijkingen. Een extra voordeel is dat dit onderzoek vroeg in de zwangerschap gedaan kan worden, hetgeen draagsters de zekerheid geeft gezonde zonen te krijgen.

Met dank aan A.N.de Ruijter, M.E.M.Kraakman en E.D.M.Post voor de assistentie bij het onderzoek en het vervaardigen van het manuscript.

Literatuur

  1. Cooper MD, Chae HP, Lowman JT, Krivit W, Good R. TheWiskott-Aldrich syndrome. An immunologic deficiency disease involving theafferent limb of immunity. Am J Med 1968; 44: 499-513·

  2. Schuurman RKB, Mensink EJBM, Schot JDL. Molecular biologyand genetics of the immune system and immunodeficiency diseases. In: ThompsonRA, ed. Recent advances in clinical immunology. Edinburgh:Churchill-Livingstone, 1987: 201-20.

  3. Prchal JT, Carroll AJ. Prchal JF, et al. Wiskott-Aldrichsyndrome: cellular impairments and their implication for carrier detection.Blood 1980; 56: 1048-54.

  4. Nahm MH, Blaese RM, Crain MJ, Briles DE. Patients withWiskott-Aldrich syndrome have normal IgG2 levels. J Immunol 1986; 137:3484-7.

  5. Parkman R, Remold-O'Donnell E, Kenney DM, Perrine S,Rosen FS. Surface protein abnormalities in lymphocytes and platelets frompatients with Wiskott-Aldrich syndrome. Lancet 1981; ii: 1387-9.

  6. Remold-O'Donnell E, Kenney DM, Parkman R, Cairns L,Savage B, Rosen FS. Characterization of a human lymphocyte surfacesialoglycoprotein that is defective in Wiskott-Aldrich syndrome. J Exp Med1984; 159: 1705-23.

  7. Mentzer SJ, Remold-O'Donnell E, Crimmins MAV, BiererBE, Rosen FS, Burakoff SJ. Sialophorin, a surface sialoglycoprotein defectivein the Wiskott-Aldrich syndrome, is involved in human T lymphocyteproliferation. J Exp Med 1987; 165: 1383-92.

  8. Axelsson B, Youseffi-Etemad R, Hammarström S,Perlmann P. Induction of aggregation and enhancement of proliferation andIL-2 secretion in human T cells by antibodies to CD43. J Immunol 1988; 141:2912-7.

  9. Mensink EJBM, Schuurman RKB. Immunodeficiency diseasegenes on the X-chromosome. Disease Markers 1987; 5: 129-40.

  10. Kwan S-P, Sandkuyl LA, Blaese M, et al. Genetic mappingof the Wiskott-Aldrich syndrome with two highly linked polymorphic DNAmarkers. Genomics 1988; 3: 39-43.

  11. Peacocke M, Siminovitch KA. Linkage of theWiskott-Aldrich syndrome with polymorphic DNA sequences from the humanX-chromosome. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 3430-3.

  12. Mensink EJBM, Thompson A, Schot JDL, Greef WMM van de,Sandkuyl LA, Schuurman RKB. Mapping of a gene for X-linked agammaglobulinemiaand evidence for genetic heterogeneity. Hum Genet 1986; 73: 327-32.

  13. Ott J. Genetic counseling. In: Analysis of human geneticlinkage. Baltimore: The Johns Hopkins University Press, 1985:192-3.

  14. Darras BT, Francke U. A partial deletion of the musculardystrophy gene transmitted twice by an unaffected male. Nature 1987; 329:556-8.

  15. Bech-Hansen NT, Starozik DM, Dimnik L, Hoar DI, MeschinoW. Interstitial deletion and male-gonadal mosaicism as the basis for Duchennemuscular dystrophy. Am J Hum Genet 1987; 41: A93.

  16. Youssoufian H, Antonarakis SE, Kasper CK, Phillips DG,Kazazian HH. The spectrum and origin of mutations in haemophilia A. Am J HumGenet 1987; 41: A249.

  17. Camerino G, Mattei MG, Mattei JF, Jaye M, Mandel JL.Close linkage of fragile X-mental retardation syndrome to haemophilia B andtransmission through a normal male. Nature 1983; 306: 701-4.

  18. Hendriks RW, Mensink EJBM, Kraakman MEM, Thompson A,Schuurman RKB. Evidence for male X-chromosomal mosaicism in X-linkedagammaglobulinemia. Hum Genet 1989; 83: 267-70.

  19. Fearon ER, Winkelstein JA, Civin CI, Pardoll DM,Vogelstein B. Carrier detection in X-linked agammaglobulinemia by analysis ofX-chromosome inactivation. N Engl J Med 1987; 316: 427-31.

  20. Puck JM, Nussbaum RL, Conley ME. Carrier detection inX-linked severe combined immunodeficiency based on patterns of X-chromosomeinactivation. J Clin Invest 1987; 79: 1395-1400.

  21. Greer WL, Kwong PC, Peacocke M, Ip P, Rubin LA,Siminovitch KA. X-chromosome inactivation in the Wiskott-Aldrich syndrome: amarker for detection of the carrier state and identification of cell lineagesexpressing the gene defect. Genomics 1989; 4: 60-7.