Alternatieven voor dierproeven
Open

Stand van zaken
14-10-1991
C.F.M. Hendriksen

Een optimale gezondheidszorg is mede afhankelijk van goed medisch wetenschappelijk onderzoek. Voor een niet onbelangrijk deel berust dit op dierexperimenteel onderzoek. Nederland kent circa 90 instellingen waar dierproeven worden uitgevoerd. In 1989 gebruikten deze instellingen 1,01 miljoen dieren.1 Schattingen over het jaarlijkse proefdiergebruik in de wereld lopen uiteen van 100-200 miljoen.2 Figuur 1 geeft een verdeling van het proefdiergebruik voor de verschillende toepassingsgebieden. Tevens is per toepassingsgebied aangegeven welk percentage van de dieren ernstig ongerief van de procedure ondervindt.

Over het belang van dierproeven voor onze gezondheidszorg wordt regelmatig gepubliceerd, ook in dit tijdschrift.3-5 In brede lagen van de maatschappij wordt dit belang onderkend. Uit opiniepeilingen gehouden in de V.S. en het Verenigd Koninkrijk blijkt dat minder dan 15 van de bevolking elke vorm van dierexperimenteel onderzoek afwijst.6 De meerderheid vindt dat in het algemeen onderzoek op dieren geoorloofd is, maar dat het aan regels en voorschriften gebonden dient te zijn. Deze houding heeft in de meeste westerse landen geleid tot een wetgeving op het gebied van proeven met (gewervelde) dieren. Zo is in een wettelijk kader vastgelegd onder welke voorwaarden dieren voor onderzoek mogen worden gebruikt en zijn waarborgen gegeven met betrekking tot het welzijn van dieren in een experiment. Grote verschillen in wetgeving tussen de diverse landen bestaan er niet. Relevant voor de Nederlandse situatie zijn vooral de Wet op de dierproeven uit 1977 en de Council Directive van de EG betreffende de bescherming van dieren die voor experimentele doeleinden worden gebruikt (1986).

De huidige wetgeving heeft aanleiding gegeven tot de uitspraak dat proefdieren in het biomedisch onderzoek beter worden beschermd dan mensen.7 Dit statement verliest echter aan kracht indien gekeken wordt naar de realiteit van het onderzoek. Immers, qua belasting zijn dierproeven van een totaal andere orde dan experimenten op mensen. Zo ondervond in 1989 circa 26 van de dieren ernstig ongerief als gevolg van de experimentele ingreep,1 waarbij gedacht kan worden aan letale ‘challenge’-proeven en experimentele tumormodellen. Het is dan ook niet zonder reden dat in de bestaande wetgeving veel belang wordt gehecht aan alternatieven, waaronder verstaan moet worden methoden in het onderzoek die leiden tot vervanging, vermindering en (of) verfijning van het proefdiergebruik.

In dit artikel wordt nader op het onderwerp ‘alternatieven’ ingegaan. Naast een begripsomschrijving wordt een overzicht gegeven van bestaande methoden. Verder wordt ingegaan op de redenen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van alternatieven. Ten slotte worden de voorwaarden geschetst voor een effectief beleid gericht op de introductie van alternatieven in het biomedisch onderzoek.

ALTERNATIEVEN VOOR DIERPROEVEN

Uitgangspunt voor een bespreking van het begrip alternatieven vormen de drie V's van Russell en Burch. In 1959 stelden deze Engelse onderzoekers dat dierexperimenteel onderzoek voortdurend getoetst diende te worden aan de mogelijkheden om het proefdiergebruik te vervangen, te verminderen en (of) te verfijnen.8 Benadrukt dient te worden dat alternatieven derhalve meer omvatten dan alleen (proefdiervrije) in vitro-methoden.

Tegenwoordig is een groot aantal technieken en middelen beschikbaar die aan het uitgangspunt van de drie V's voldoen. Globaal kunnen ze worden ingedeeld in de volgende categorieën:9

Levende niet-gewervelde organismen.

Bacteriën, invertebraten of het gebruik van in vitro-systemen zoals celkweek en orgaancultuur zijn hiervan voorbeelden.

Niet-levende systemen.

Hierbij kan een onderverdeling gemaakt worden in:

– fysische en chemische systemen zoals ‘high pressure liquid chromatography’ (HPLC) die onder andere wordt toegepast als alternatief voor de muis-convulsietest in de werkzaamheidsbepaling van insulinepreparaten;

– immunologische methoden zoals de ‘enzyme linked immunosorbent assay’ (ELISA) en de ‘single radial immunodiffusion’ (SRID); deze methoden vervangen in toenemende mate (gedeelten van) bioassays in de controle van vaccins;

– biotechnologische methoden die gebruik maken van monoklonale antistoffen, polymerasekettingreactie (PCR) en dergelijke.

Computerprogramma's en audiovisuele hulpmiddelen.

In dit verband zijn te noemen de structuur-activiteit-relatiemodellen (QSAR) of de interactieve videoprogramma's, welke laatste vooral binnen het onderwijs toepassing vinden.

Verbetering van bestaande procedures, technieken of diermodellen.

Mogelijkheden doen zich onder andere voor op het punt ‘verfijning’, zoals de toepassing van verbeterde biotechnische handelingen, het gebruik van analgesie bij invasieve ingrepen of een verbetering van huisvestingsomstandigheden. Daarnaast kan ook gedacht worden aan vermindering van het diergebruik door middel van harmonisatie van de regelgeving, bijvoorbeeld binnen de wettelijk geregelde kwaliteitscontrole van vaccins.

Veel van de genoemde methoden en technieken zijn inmiddels onmisbaar geworden in diverse disciplines van het biomedisch onderzoek. Drie actuele ontwikkelingen worden nader besproken.

De eerste fase in het innovatieve geneesmiddelenonderzoek betreft een farmacologische screening van mogelijk interessante verbindingen. In het recente verleden geschiedde dit min of meer op ‘trial and error’-basis en waren grote aantallen proefdieren nodig. De laatste jaren heeft een verschuiving plaatsgevonden van screening bij proefdieren naar een voorselectie van potentieel bruikbare verbindingen via QSAR en receptor-bindingsstudies in celculturen en subcellulaire systemen.10 Het aantal verbindingen dat uiteindelijk aan een farmacologische evaluatie in vivo met proefdieren wordt onderworpen, is hierdoor sterk gereduceerd.

Een tweede ontwikkeling betreft het werkzaamheidsonderzoek in het kader van de kwaliteitscontrole van vaccins. Overeenkomstig de richtlijnen berust dit onderzoek veelal op de werkzaamheid van een vaccin in een letaal challengemodel. Voor belangrijke vaccins zoals difterie- en tetanusvaccin zijn recentelijk serologische methoden ontwikkeld, waardoor de met ernstig ongerief gepaard gaande letale challenge van de proefdieren vervangen kan worden door een bloedafname. Een bijkomend voordeel hiervan is dat de precisie toeneemt, waardoor het benodigde aantal dieren per test kan worden gereduceerd.11

Het derde voorbeeld betreft de diagnostiek van tuberculose. Tot voor kort was de cavia hiervoor het model bij uitstek. Inmiddels zijn (in vitro-)kweekmethoden zover geoptimaliseerd dat ze in gevoeligheid niet meer onderdoen voor de cavia.12 De introductie van de PCR-techniek zal een verdere verbetering van de in vitro-diagnostiek betekenen. Hierdoor kan het gebruik van de cavia voor de tuberculosediagnostiek worden teruggebracht tot die sporadische gevallen waarin de diagnose bij patiënten bij wie tuberculose klinisch wordt vermoed niet wordt bevestigd door kleuring, in vitro-kweek en (of) PCR.

WAAROM ALTERNATIEVEN VOOR DIERPROEVEN?

Er zijn verschillende redenen om te zoeken naar alternatieven voor dierproeven. Allereerst brengt de status van het medisch wetenschappelijk onderzoek impliciet een morele verplichting met zich mee. Kenmerk van dit onderzoek is namelijk dat het voortkomt uit respect en zorg voor het leven van de mens. Hoewel er natuurlijk verschillen in waarde zijn tussen het leven van een mens en het leven van een dier, zijn er geen rationele argumenten aan te voeren om het uitgangspunt van respect voor het leven niet ook van toepassing te laten zijn op het dier. Daarom dient de uiterste voorzichtigheid in acht genomen te worden bij gebruik van dieren voor onderzoek. Deze opvatting is onder andere verwoord door de Raad van Europa,13 en in de nota ‘Rijksoverheid en Dierenbescherming’ van het voormalige ministerie van Cultuur, Recreatie en Maatschappelijk Werk.14

De belangstelling voor alternatieven hoeft echter niet alleen afhankelijk te zijn van morele overwegingen, maar kan ook ingegeven worden door pragmatische argumenten. Zo wordt in toenemende mate onderkend dat een welzijnsaantasting van proefdieren de kwaliteit van het onderzoek negatief kan beïnvloeden. Aangetoond is dat langdurige huisvesting onder prikkelarme omstandigheden tot neuro-endocriene en immunologische veranderingen kan leiden.15

Voor veel in vitro-modellen geldt dat ze in praktisch en economisch opzicht voordelen bieden boven de diermodellen. Dit wordt geïllustreerd door de toxinebindingsinhibitie (ToBI)-test: een in vitro-methode voor de bepaling van antistoftiters tegen difterie en tetanus in patiëntensera (tabel). Deze methode werd ontwikkeld bij het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiëne (RIVM) en is inmiddels geaccepteerd als vervanging van de bepalingsmethode met muizen. Zoals uit de tabel blijkt, is de ToBI-test in meerdere opzichten beter dan de in vivo-test.

Ten slotte zijn ook wetenschappelijke voordelen te noemen die veel alternatieven aantrekkelijk maken. Voor veel van de in vitro-methoden geldt dat ze wetenschappelijke mogelijkheden bieden op punten waar diermodellen te kort schieten. Zo verdiept het gebruik van de weefselkweektechniek in het toxicologisch en farmacologisch onderzoek de kennis over het werkingsmechanisme van stoffen op cellulair en moleculair niveau. Dit betekent overigens niet dat de weefselkweek het proefdier volledig kan vervangen. Complexe fysiologische processen zoals de interactie van orgaansystemen en biotransformatie, die vaak een belangrijke rol spelen in het werkingsmechanisme van een stof, zijn niet in een relatief eenvoudig weefselkweekmodel te vangen. Dit betekent dat voor een uiteindelijke toetsing het totale levende organisme vooralsnog onmisbaar blijft. Op basis van gegevens uit in vitro-studies kan onderzoek met proefdieren echter gefundeerder plaats vinden, hetgeen het totale aantal gebruikte dieren kan verminderen.

DE STAND VAN ZAKEN

De kracht van alternatieven ligt vooral in het effect van een combinatie van de ethische, de economische, de praktische en de wetenschappelijke voordelen. De drie V's vormen dan ook een gemeenschappelijk uitgangspunt voor groeperingen die in discussies over dierproeven veelal elkaars antipoden zijn. Dit blijkt onder andere uit het feit dat de vele (inter)nationale prijzen en fondsen die j aarlijks beschikbaar worden gesteld voor werk op het gebied van alternatieven afkomstig zijn uit zo diverse organisaties, zoals dierenbescherming, overheid of industrie. Vooral Nederland onderscheidt zich in positieve zin doordat deze organisaties hier frequent hun krachten bundelen. Illustratief in dit opzicht is het Platform Alternatieven voor dierproeven, een samenwerkingsverband tussen verschillende ministeries, de dierenbescherming, de industrie en particuliere organisaties. Jaarlijks worden vanuit dit Platform projecten op het gebied van alternatieven gesubsidieerd.

Vermeldenswaardig zijn de centra voor alternatieven. Ze spelen een belangrijke rol bij het initiëren en stimuleren van dergelijk onderzoek. In de V.S. is dit het Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing en in het Verenigd Koninkrijk de organisatie Fund for the Replacement of Animals in Medical Experiments (FRAME). Beide centra ondersteunen vooral onderzoek naar de toepassing van in vitro-methoden in het toxicologisch onderzoek. Daarnaast geeft FRAME het tijdschrift Alternatives to Laboratory Animals uit. Ook in Duitsland en Zwitserland bestaan centra voor alternatieven. In Duitsland is ZEBET, een afdeling van het Bundes Gesundheitsamt actief, in Zwitserland is dit SIAT. Onlangs is binnen het RIVM een coördinatiepunt voor alternatieven ingesteld. Dit coördinatiepunt richt zich in het bijzonder op de ontwikkeling en validering van alternatieven in gebieden waarop het RIVM onderzoek doet. Ook de Rijksuniversiteit te Utrecht werkt aan de totstandkoming van een centrum voor alternatieven voor dierproeven.

Duidelijke signalen vanuit de samenleving om alternatieve methoden toe te passen, gaan uit van de bestaande wetgeving. Zo stelt art.10 van de Wet op de dierproeven dat het verboden is dieren te gebruiken voor een doel dat, naar de algemeen kenbare, onder deskundigen heersende opvatting, ook anders dan door middel van een dierproef kan worden bereikt. Expliciet is art. 23 van de Council Directive van de EG (86609EC). Hierin wordt niet alleen aan het gebruik van alternatieve methoden, maar ook aan de ontwikkeling ervan prioriteit toegekend.16 Het belang dat de overheid aan de 3 V's toekent, wordt in toenemende mate gesteund door wetenschappelijke organisaties. Zo publiceerde in 1985 de Council for International Organizations of Medical Sciences een richtlijn voor het gebruik van dieren in biomedisch onderzoek.17 Het belang van alternatieve methoden wordt in de richtlijn onderstreept.

Ondanks al deze activiteiten bestaat er behoefte aan versterking van een gericht beleid ten aanzien van alternatieven. Te vaak is de introductie van alternatieven nog afhankelijk van toevallige ontwikkelingen binnen het reguliere onderzoek. Hierdoor worden de mogelijkheden niet optimaal benut.

HET EFFECT VAN ALTERNATIEVEN

Over het effect van alternatieven op het gebruik van dieren zijn geen cijfers bekend. Weliswaar is het proefdiergebruik in landen die een registratieplicht kennen, dalende (figuur 2), maar onduidelijkheid bestaat over het aandeel van alternatieven hierin. Ongetwijfeld hebben ook andere ontwikkelingen aan de daling een bijdrage geleverd. Gedacht kan worden aan een zorgvuldiger gebruik van dieren (bijvoorbeeld vanwege de hoge kosten), aan bezuinigingen in het wetenschappelijk onderzoek, aan een kwaliteitsverbetering van proefdieren en dierproeven of aan een verminderde beschikbaarheid van bepaalde diersoorten, zoals van apen.

Het geheel van het biomedisch onderzoek overziend, moet geconstateerd worden dat alternatieven in de zin van proefdiervervangend nog schaars zijn, ondanks het grote arsenaal aan methoden dat ons thans ter beschikking staat. Globaal gesproken, zijn de achterliggende oorzaken terug te voeren op twee factoren. In de eerste plaats zijn de meeste (in vitro-)modellen gebaseerd op relatief eenvoudige systemen, hetgeen slecht spoort met het feit dat aan veel fysiologische en pathologische fenomenen een complex reactiepatroon ten grondslag ligt. Deze beperking van alternatieven doet zich vooral gelden op gebieden van het biomedisch onderzoek waarbij intersysteem-reacties een belangrijke rol spelen, zoals kankeronderzoek of onderzoek van chronische ziekten.

In zijn algemeenheid kan worden gesteld dat naarmate de specificiteit van de vraagstelling toeneemt, de mogelijke toepassing van in vitro-methoden groter wordt. Illustratief in dit verband is het klinisch microbiologisch onderzoek. Voor de bestudering van de pathogenese is veelal een goed diermodel vereist, terwijl voor de diagnostiek in vitro-methoden zoals kweek, immunofluorescentie, PCR en dergelijke het proefdier steeds meer verdringen.

Een tweede reden voor de beperkte toepassing van in vitro-methoden heeft te maken met onvolledigheden in het validatie-onderzoek. Validatie-onderzoek dient om op een ondubbelzinnige manier aan te tonen dat de in vitro-methode minstens even goed is als de bestaande dierproef. Vooral bij het onderzoek in het kader van de regelgeving zoals vaccincontrole en toxicologisch onderzoek, is validatie van essentieel belang. Een wijziging of harmonisatie in de regelgeving ten gunste van een alternatieve methode stuit vaak op moeilijkheden door onduidelijkheden in de validatie. Helaas is validatie-onderzoek, wetenschappelijk gezien, weinig interessant en organisatorisch gezien gecompliceerd. Hierdoor komen proefdiervervangende alternatieve methoden vaak niet verder dan de ontwikkelingsfase en blijft praktische toepassing achterwege. Dit geldt bijvoorbeeld voor de in vitro-modellen die ontwikkeld zijn als alternatief voor de oogirritatie-test in de toxicologie.

Ook de activiteiten die gericht zijn op een verfijning van het onderzoek worden niet optimaal benut. Het kernprobleem is hier vooral dat zaken zoals welzijn en ongerief bij proefdieren zich moeilijk eenduidig laten definiëren. Zo verschillen de meningen over fundamentele zaken zoals pijngewaarwording of huisvestingsbehoeften. Het gevolg kan zijn dat een adequate analgesie of huisvesting achterwege blijft.

AANBEVELINGEN

In 1986 stelde Van Bekkum over dierproeven in dit tijdschrift dat alternatieve methoden de behoefte aan dierproeven op den duur niet wezenlijk zullen verminderen.4 Ook in dit artikel zijn enige kritische kanttekeningen geplaatst bij het effect van alternatieven op vervanging van het proefdiergebruik. Dit mag echter niet leiden tot het bagatelliseren van het belang van alternatieven, een gevaar dat bestaat wanneer te zeer het accent gelegd wordt op (proefdiervervangende) in vitro-methoden.

Uit het voorgaande moge duidelijk geworden zijn dat het begrip ‘alternatieven’ een ruimere betekenis heeft dan proefdiervervanging en ook methoden omvat die leiden tot een vermindering of verfijning van het proefdiergebruik in bestaande tests. In dit verband zijn te noemen de recente wijzigingen in de veel bekritiseerde LD50-test en in het werkzaamheidsonderzoek van vaccins. Ook dient onderstreept te worden dat de voorhanden zijnde mogelijkheden onvoldoende worden benut. Een gericht alternatievenbeleid kan hier verandering in brengen. Van primair belang is een ruimere financiële ondersteuning van dit onderzoek. Het reeds genoemde Platform Alternatieven voor dierproeven beschikt helaas over een ontoereikend budget, waardoor goede project-voorstellen bij gebrek aan financiering blijven liggen. Zo konden in 1990 slechts 6 van de 20 door het Platform goedgekeurde projectvoorstellen (er waren in totaal 66 projectvoorstellen ingediend) worden gehonoreerd.

Daarnaast wordt in nog maar weinig onderzoeksinstellingen de ontwikkeling van alternatieven actief ondersteund en blijft de aandacht beperkt tot methoden met een duidelijke innovatieve wetenschappelijke waarde. Het zou dan ook zinvol zijn om binnen de grote onderzoeksinstellingen, conform de RIVM-constructie, coördinatiepunten voor onderzoek naar alternatieven op te zetten. Van hieruit kan onderzoek in deze richting worden geïnitieerd en gestimuleerd. Gedacht kan worden aan een thematische aanpak waarbij allereerst de potentiële mogelijkheden van alternatieven binnen een vakgebied worden geïnventariseerd en vervolgens concrete voorstellen worden uitgewerkt.

In het verlengde van coördinatiepunten per instituut ligt de aanbeveling om tot de oprichting van een nationaal en een internationaal centrum voor alternatieven te komen. Deze centra zullen zich in het bijzonder dienen te richten op de opslag van gegevens, het initiëren en coördineren van validatie-onderzoek en het bevorderen van harmonisatie van de regelgeving. Vooral dit laatste kan tot een aanzienlijke reductie van het proefdiergebruik leiden, omdat een wederzijdse erkenning van elkaars testresultaten de noodzaak om onderzoek te herhalen overbodig maakt. Inmiddels is binnen de EG een procedure gestart voor een Europees centrum. Helaas is uiteindelijk, en dit vooral uit politieke overwegingen, niet gekozen voor vestiging van dit centrum in Nederland maar in Italië. Dit is jammer omdat Nederland met betrekking tot dierproeven, in tegenstelling tot veel andere landen, een uitstekende infrastructuur bezit, met name dankzij het goede overlegklimaat tussen overheid, wetenschap, dierenbeschermende verenigingen en industrie.

Een actieve integratie van alternatieve methoden in het wetenschappelijk onderzoek kan ook worden bevorderd door het opstellen van ‘codes of practice’, hetzij door een wetenschappelijke organisatie, hetzij door een andere instantie. In Nederland is de Veterinaire Hoofdinspectie actief in dezen. Zo is onlangs een code of practice verschenen voor de produktie van monoklonale antistoffen. Binnenkort zullen richtlijnen verschijnen voor het diagnostisch onderzoek en voor het gebruik van adjuvantia. Met betrekking tot dit laatste onderwerp zullen beperkingen worden gesteld aan het gebruik van compleet Freund's adjuvant.

Belangrijk voor de toepassing van alternatieven is alertheid op de mogelijkheden hiertoe van ieder die bij dierexperimenteel onderzoek betrokken is. Deze alertheid behoort bij een attitude die gericht is op zorgvuldigheid bij opzet en uitvoering van dierproeven. Nederland is in dit opzicht uniek, daar het wettelijk verplichte opleidingseisen kent voor onderzoekers, biotechnici en proefdierdeskundigen. Zo dient iedere onderzoeker naast een doctoraal diploma in een biomedische studierichting ook een cursus proefdierkunde te volgen alvorens zelfstandig dierexperimenteel onderzoek te mogen uitvoeren. Een belangrijke doelstelling van deze cursus is aankomende onderzoekers vertrouwd te maken met de drie V's.18

Wetgeving, opleiding en financiële ondersteuning zijn niet meer dan hulpmiddelen. Een werkelijk effectief alternatievenbeleid heeft alleen kans van slagen als het voortkomt uit een toenemend besef onder individuele onderzoekers dat zij specifieke verantwoordelijkheden hebben ten aanzien van het proefdier.

Met dank aan prof.dr.L.F.M.van Zutphen, hoogleraar proefdierkunde, Faculteit Diergeneeskunde, Utrecht, voor zijn kritisch commentaar.

Literatuur

  1. Veterinaire Hoofdinspectie van de Volksgezondheid. Zodoende 1989. Jaaroverzicht van de Sectie dierproeven. Rijswijk: VeterinaireHoofdinspectie van de Volksgezondheid, 1990.

  2. Balls M. Replacing experiments on laboratory animals. TIBS1986; 11: 236-8.

  3. Feron VJ, Vrijer F de, Heijden CA van der.Carcinogeniteitsonderzoek bij proefdieren. I. Opzet en uitvoering.Ned Tijdschr Geneeskd 1986; 130:1049-51.

  4. Bekkum DW van. Dierproeven.Ned Tijdschr Geneeskd 1986; 130:1045-8.

  5. Bakker-Woudenberg IAJM. De waarde van diermodellen voorklinisch onderzoek van antimicrobiële middelen.Ned Tijdschr Geneeskd 1990; 134:1889-92.

  6. Rowan AN. Why scientists should seek alternatives toanimal use. Technology Review 1986; MayJune: 22-3.

  7. Bekkum DW van. In: Wolters WHG, ed. Medische experimentenmet mensen. Mogelijkheden en grenzen. Utrecht: Bohn, Scheltema & Holkema,1980: 14-23.

  8. Russell WMS, Burch RL. The principles of humanexperimental technique. London: Methuen, 1959.

  9. Office of Technology Assessment. Alternatives to animaluse in research, testing and education. OTA Publ. Nr OTA-BA-273. WashingtonDC: U.S. Government Printing Office, 1986.

  10. Jonge A de, Reinders JH, Pereboom WJ. The role of animalexperiments and alternatives in industrial pharmacological research. In:Hendriksen CFM, Koëter HBWM, eds. Animals in biomedical research.Amsterdam: Elsevier, 1991: 111-9.

  11. Hendriksen CFM. Laboratory animals in vaccine productionand control; replacement, reduction and refinement. Dordrecht: Kluwer,1988.

  12. Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Microbiologie.Isolierung und Identifizierung von Mycobacteriaceae. Zentralbl Bakteriol 989;272: 110-40.

  13. Estoppey-Stojanowski L. Council of Europe policy onprotection of animals. Dev Biol Standard 1986; 64: 3-5.

  14. Tweede Kamer. Vergaderjaar 1981-1982. Rijksoverheid enDierenbescherming. Nota van de afdeling Voorlichting van het ministerie vanCultuur, Recreatie en Maatschappelijk werk. Nr 16966-2. Rijswijk: ministerievan Cultuur, Recreatie en Maatschappelijk Werk, 1982.

  15. Reese EP. The role of animal husbandry in promotingrefinement and reduction. In: Hendriksen CFM, Koëter HBWM, eds. Animalsin biomedical research. Amsterdam: Elsevier, 1991: 155-93.

  16. The Council of the European Communities. CouncilDirective 86609EC on the approximation of laws, regulations andadministrative provisions of the Member States regarding the protection ofanimals used for experimental and other scientific purposes. Official Journalof the European Communities, series L 1986; nr 358: 1-28.

  17. Howard-Jones N. A CIOMS ethical code for animalexperimentation. WHO Chron 1985; 39: 51-6.

  18. Zutphen LFM van, Rozemond H, Beynen AC, eds. Animalexperimentation: legislation and education. Utrecht: Department of LaboratoryAnimal Science, Utrecht State University, 1989.